高燦紅，董麗麗，關(guān)曉彎，趙良俠，林俊城，徐福樂，張水明*

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，合肥 230036；2 福州超大現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，福州 350003)

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青花菜蘿卜硫素合成相關(guān)基因BoCYP83A1的克隆與表達(dá)分析

高燦紅1，董麗麗1，關(guān)曉彎1，趙良俠1，林俊城2，徐福樂2，張水明1*

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，合肥 230036；2 福州超大現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，福州 350003)

CYP83A1基因是蘿卜硫素合成代謝中的關(guān)鍵基因，該試驗(yàn)以青花菜品種CDBY-10為材料，利用RACE和RT-PCR方法，獲得BoCYP83A1基因的全長(zhǎng)序列。該基因全長(zhǎng)1 509 bp，編碼502個(gè)氨基酸，包含保守的P450結(jié)構(gòu)域。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了BoCYP83A1基因在不同品種、不同組織以及不同激素處理下的表達(dá)水平。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，BoCYP83A1與結(jié)球甘藍(lán)親緣關(guān)系最近。BoCYP83A1基因在不同品種間的組織特異性不同：在青花菜品種CDBY-10的根、莖、葉3個(gè)組織間表達(dá)水平差異較小，在品種CDBY-12中表現(xiàn)為莖>葉>根，在CDBY-14中則表現(xiàn)為根>莖>葉。MeJA及SA處理均能夠引起B(yǎng)oCYP83A1基因表達(dá)量的變化：經(jīng)MeJA處理后，BoCYP83A1基因表達(dá)量升高至對(duì)照的1.9倍，而后有少量下降；經(jīng)SA處理后，BoCYP83A1基因表達(dá)水平迅速降低，在6 h時(shí)降低至對(duì)照的0.1倍，而后逐漸回升至對(duì)照的表達(dá)水平。研究表明，BoCYP83A1基因在不同青花菜品種中的表達(dá)特性不同，其表達(dá)能夠被MeJA和SA所調(diào)控。青花菜BoCYP83A1的克隆及鑒定為培育高蘿卜硫素含量的青花菜新品種奠定了理論基礎(chǔ)。

青花菜; 蘿卜硫素;BoCYP83A1; 茉莉酸甲酯；水楊酸

青花菜 (Brassicaoleracea. var.italicaPlanch)營(yíng)養(yǎng)豐富且具有保健效果，是發(fā)達(dá)國(guó)家進(jìn)口量最大的蔬菜之一，被譽(yù)為“蔬菜皇冠”[1]。青花菜最具特色的是富含功能成分——蘿卜硫素 (Sulforaphane, SF)，該成分具有極強(qiáng)的促進(jìn)致癌物解毒、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的功效，在癌癥前期、中期、擴(kuò)散期均能發(fā)揮作用，是迄今為止在蔬菜中發(fā)現(xiàn)的抗癌活性最強(qiáng)的天然活性成分[2-3]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因工程手段提高蘿卜硫素的含量成為青花菜育種的新方向。

蘿卜硫素于1992年在青花菜中被發(fā)現(xiàn)[4]，是由脂肪族硫苷(Aliphatic glucosinolates)4-甲基亞磺酰丁基硫苷 (Glucoraphanin，RAA)降解生成的一種異硫氰酸鹽。研究表明，蘿卜硫素的合成代謝途徑較為復(fù)雜，主要分5個(gè)階段完成。首先合成前端產(chǎn)物甲硫氨酸，隨后以甲硫氨酸為起始底物，經(jīng)過側(cè)鏈的延伸、硫苷核心結(jié)構(gòu)的形成和側(cè)鏈的二次修飾等3個(gè)階段形成RAA。最后，RAA在黑芥子酶作用下分解成蘿卜硫素[5-7]。此生物過程涉及HMT、MAM、CYP79/CYP83、AOP等多個(gè)合成基因家族[6]。如BoHMT處于蘿卜硫素合成代謝途徑的最前端，對(duì)甲硫氨酸的含量水平起關(guān)鍵調(diào)控作用[5];MAM1是MAM基因家族中控制底物甲硫氨酸側(cè)鏈延伸，形成短鏈硫苷初產(chǎn)物的基因[5]；CYP79/CYP83基因家族是硫苷核心結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵基因，其中CYP79F1催化合成長(zhǎng)鏈硫苷[6]，CYP83A1則調(diào)控硫苷向脂肪類硫苷合成；硫苷側(cè)鏈二次修飾過程中主要受AOP基因家族調(diào)控，其中AOP2和AOP3分別催化形成烯烴基硫苷和羥烷基硫苷[7]。CYP83A1基因是細(xì)胞色素氧化酶P450基因家族之一[8]，目前在擬南芥[9-11]、油菜[12]、小白菜[13]、西蘭花[14]等多種植物中被鑒定。將擬南芥中CYP83A1基因在白菜中過量表達(dá)，白菜中脂肪族芥子油苷和總芥子油苷含量分別增加4.5和2倍[15]。西蘭花CYP83A1基因在擬南芥中過量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株中脂肪族芥子油苷4MSOB和4MTB均有明顯上升，且脂肪族芥子油苷總量升高[14]。將薺菜中的BjuCYP83A1-1在擬南芥中過表達(dá)引起了脂肪族芥子油苷的積累，總?cè)~片芥子油苷增加1.41～1.78倍, 轉(zhuǎn)基因植株中脂肪族芥子油苷增加1.53～1.96倍[16]。綜合上述研究，CYP83A1基因的過量表達(dá)能夠引起脂肪族芥子油苷或總芥子油苷含量的增加，而蘿卜硫素的形成以脂肪族芥子油苷的分解為前提，因此脂肪族芥子油苷含量的提高可能直接引起蘿卜硫素含量的升高。

本研究利用RACE方法從青花菜中克隆了BoCYP83A1基因的全長(zhǎng)序列，并分析了BoCYP83A1在不同品種、不同組織間及MeJA和SA激素處理?xiàng)l件下的表達(dá)特性。該研究不但為進(jìn)一步研究BoCYP83A1的分子生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，也為高含量蘿卜硫素的新品種培育提供了基因?qū)＠?/p>

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

選3個(gè)蘿卜硫素含量不同的青花菜品種CDBY-10、CDBY-12和CDBY-14為試驗(yàn)材料，開展青花菜不同品種、不同組織間基因表達(dá)差異的研究。將3個(gè)品種播于標(biāo)準(zhǔn)128孔穴盤中，每個(gè)品種10株，3次重復(fù)。正常育苗管理至3葉1心時(shí)取樣。分別將同一重復(fù)的10株分根、莖、葉3種器官取樣，迅速用液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱儲(chǔ)藏備用。

以CDBY-12為試驗(yàn)材料，開展外源激素調(diào)控下基因的表達(dá)差異研究。采用紙培法將CDBY-12播種于發(fā)芽盒 (10 cm×10 cm)中，用5 mL蒸餾水將濾紙濕潤(rùn)，然后有序播種100粒以保證株行距一致，每個(gè)處理播種3個(gè)重復(fù)。待發(fā)芽5 d時(shí)，分別用1 mmol/L MeJA和3 mmol/L SA噴施處理，以噴施蒸餾水的處理為對(duì)照，噴施量控制一致。噴施處理后3、6 和9 h各取樣1次，迅速浸入液氮速凍，后轉(zhuǎn)入-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1基因全長(zhǎng)序列的克隆采用Trizol法抽提青花菜葉片的總RNA，并使用SMARTTMRACE cDNA Amplication Kit (Clontech)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)NCBI上已登錄的擬南芥、油菜、蘿卜等物種的CYP83A1序列設(shè)計(jì)引物83-PF和83-PR，進(jìn)行擴(kuò)增以獲得中間片段。根據(jù)獲得的序列設(shè)計(jì)3’正向引物F3′1、F3′2和反向引物R5′1、R5′2，隨后與錨定引物UPM、NUP進(jìn)行5′和3′末端的擴(kuò)增。將三部分進(jìn)行拼接得到基因的全長(zhǎng)序列。設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物83HS-F和83HS-R，利用高保真酶Primer STAR HS進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以對(duì)拼接的全長(zhǎng)序列進(jìn)行校正。

1.2.2基因生物信息學(xué)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建利用DNAMAN 2.6進(jìn)行不同物種間蛋白序列的比對(duì)；采用鄰接法在MEGA中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)置Bootstrap 重復(fù)分析500次。利用SignalP進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，利用PDB進(jìn)行Pfam domain和Motif預(yù)測(cè)。

1.2.3基因表達(dá)分析采用TRzol?(Invitrogen)法抽提樣品的總RNA，并使用DNase Ⅰ(TaKaRa)將殘余的DNA消化處理，隨后取2 μg RNA使用PrimeScript?RT reagent kit (Takara)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)已獲得的BoCYP83A1基因全長(zhǎng)設(shè)計(jì)引物83RT-F和83RT-R，以18S為內(nèi)參基因，按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Takara)試劑盒的具體操作步驟在ABI 7500熒光定量?jī)x上進(jìn)行擴(kuò)增，相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算使用2-ΔΔCT方法。組織特異性表達(dá)分析以葉片中的表達(dá)量為對(duì)照，不同激素處理中以CK的表達(dá)量作為對(duì)照。

表1　本試驗(yàn)相關(guān)的引物序列

數(shù)據(jù)采用Excel 2003、DPS 7.05、Agilent 1100 offline studio軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1青花菜BoCYP83A1基因cDNA全長(zhǎng)的克隆

以83-PF/83-PR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得BoCYP83A1的中間片段 (圖1，A)。使用F3′1/UPM、R5′1/ UPM引物進(jìn)行第一輪的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以反應(yīng)產(chǎn)物作為模板，分別用F3′2/NUP、R5′2/NUP引物進(jìn)行第二輪的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得750 bp左右的3′片段 (圖1，C)和260 bp左右的5′片段 (圖,1，B)。將三部分進(jìn)行拼接得到1 630 bp全長(zhǎng)序列。隨后以83HS-F/83HS-R為引物，使用高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增，以對(duì)拼接的全長(zhǎng)序列進(jìn)行校正，以此確定青花菜中CYP83A1的全長(zhǎng)cDNA序列(圖1，D)。利用NCBI的ORF Finder進(jìn)行分析，青花菜CYP83A1基因全長(zhǎng)序列1 509 bp，編碼502個(gè)氨基酸 (圖2)，命名為BoCYP83A1。

2.2BoCYP83A1基因的序列及進(jìn)化樹分析

將BoCYP83A1基因編碼的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)BoCYP83A1與油菜BnCYP83A1的相似性最高，達(dá)到97.01%。與擬南芥AtCYP83A1、蘿卜RsCYP83A1相似性分別為87.67%和96.02%。

利用ESyPred3D在線預(yù)測(cè)BoCYP83A1蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，其高級(jí)結(jié)構(gòu)具有H鍵306個(gè)，螺旋數(shù)20個(gè)，轉(zhuǎn)角數(shù)44個(gè)，蛋白質(zhì)分子量為57.52 kD，等電點(diǎn)7.96。通過SignalP-NN預(yù)測(cè)該蛋白在第25～26個(gè)氨基酸的位置具有1個(gè)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。通過Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，BoCYP83A1蛋白確實(shí)為P450家族基因，結(jié)構(gòu)域跨度為第31～494氨基酸，且第4～21氨基酸序列為1個(gè)跨膜相關(guān)結(jié)構(gòu)(圖2)。

M.DL2000；A. 中間片段產(chǎn)物；B. 5’-RACE 產(chǎn)物；C. 3’- RACE產(chǎn)物；D. 全長(zhǎng)cDNA圖1　BoCYP83A1基因的擴(kuò)增結(jié)果M. DL2000；A. Internal fragment；B. 5’- RACE fragment；C. 3’ -RACE fragment, D. The full-length cDNAFig. 1　PCR amplification results of BoCYP83A1

為了確定BoCYP83A1與其他物種CYP83A1的親緣關(guān)系，利用MEGA 5.05軟件，將BoCYP83A1與已克隆的擬南芥、油菜、蘿卜、甘藍(lán)、芥菜和亞麻薺等6個(gè)物種的CYP83A1s進(jìn)行多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，BoCYP83A1和甘藍(lán)BoCYP83A1(2)的親緣關(guān)系最近，聚為一枝，而與擬南芥AtCYP83A1和亞麻薺CsCYP83A1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。

2.3BoCYP83A1基因在不同品種不同組織間的表達(dá)差異

分析青花菜BoCYP83A1基因在不同品種的根、莖、葉組織中的表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示。其中，BoCYP83A1基因在CDBY-10的3個(gè)組織間表達(dá)水平差異較小，在CDBY-12中表現(xiàn)為莖>葉>根，而在CDBY-14中則表現(xiàn)為根>莖>葉。在根系中，CDBY-14BoCYP83A1基因的表達(dá)量顯著高于其它品種。在莖中，CDBY-14BoCYP83A1基因的表達(dá)水平也相對(duì)其他品種較高，但相差較?。欢谌~片中，CDBY-10BoCYP83A1基因的表達(dá)量高于CDBY-14和CDBY-12。

2.4激素誘導(dǎo)下BoCYP83A1基因的表達(dá)差異

對(duì)不同激素不同時(shí)間處理后，BoCYP83A1基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：經(jīng)MeJA處理3 h時(shí)，BoCYP83A1基因表達(dá)量升高至對(duì)照的1.9倍；隨著時(shí)間的推移，BoCYP83A1基因表達(dá)水平在6 和9 h時(shí)有少量下降，但仍高于對(duì)照。經(jīng)SA處理3 h時(shí)，BoCYP83A1基因表達(dá)水平降低，且在6 h時(shí)達(dá)到最低，為對(duì)照的0.1倍，而9 h時(shí)有所回升，且略高于CK的表達(dá)水平(圖5)。

不同物種的CYP83A1蛋白登錄號(hào)如下：BoCYP83A1(2). 甘藍(lán) (XP_013636864); BnCYP83A1. 油菜 (NP_001303017); RsCYP83A1. 蘿卜(AHB11194.1); BjCYP83A1. 薺菜 (AGO37757); AtCYP83A1. 擬南芥 ( NP_193113)CsCYP83A1. 亞麻薺 (XP_010495830)圖3　不同物種CYP83A1s的系統(tǒng)進(jìn)化分析CYP83A1 protein accession numbers for different species are as follows: BoCYP83A1(2). Brassica oleracea var. oleracea (XP_013636864); BnCYP83A1. Brassica napus (NP_001303017); RsCYP83A1. Raphanus sativus (AHB11194.1); BjCYP83A1. Brassica juncea (AGO37757); AtCYP83A1. Arabidopsis thaliana( NP_193113)CsCYP83A1. Camelina sativa (XP_010495830)Fig. 3　Phylogenetic analysis among different CYP83A1s

不同小寫字母表示不同品種青花菜幼苗組織間基因表達(dá)量在0.05水平差異顯著性圖4　不同品種青花菜幼苗組織間BoCYP83A1基因表達(dá)差異Normal letters indicate significant difference of BoCYP83A1 expression among different cultivars or tissues of broccoli at 0.05 levelFig. 4　Expression differences of BoCYP83A1 gene among different tissues or cultivars of broccoli

3　討　論

本研究從青花菜中克隆了CYP83A1的同源基因，序列中包含保守的P450功能域結(jié)構(gòu)，因此命名為BoCYP83A1 (登錄號(hào)KU573063)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示：BoCYP83A1與其他物種的CYP83A1起源相同，確實(shí)是CYP83A1家族的同源基因，但在后來進(jìn)化的不同時(shí)期，與其他物種分離開來。BoCYP83A1與結(jié)球甘藍(lán)BoCYP83A1(2)的親緣關(guān)系最近，聚為一枝，而與擬南芥AtCYP83A1和亞麻薺CsCYP83A1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

不同小寫字母表示不同激素不同處理時(shí)間在0.05水平的差異顯著性圖5　不同激素不同時(shí)間處理下BoCYP83A1基因表達(dá)差異Normal letters indicate significant difference anomg treat ments with different hormones and times at 0.05 levelFig. 5　Expression differences of BoCYP83A1 gene of broccoli treated with different hormones and times

選取3個(gè)青花菜品種CDBY-10、CDBY-12和CDBY-14，對(duì)其不同組織中的BoCYP83A1表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。CDBY-14中BoCYP83A1的表達(dá)水平明顯高于CDBY-10和CDBY-12。不同品種中BoCYP83A1的組織特異性表達(dá)并不相同：BoCYP83A1在CDBY-10 3個(gè)組織間表達(dá)水平差異較小，在CDBY-12中表現(xiàn)為莖>葉>根，而在CDBY-14中則表現(xiàn)為根>莖>葉。說明不同品種中蘿卜硫素的合成及分布可能并不相同。研究發(fā)現(xiàn),薺菜BjuCYP83A1-1、BjuCYP83A1-2、BjuCYP83A1-3和BjuCYP83A1-4等4個(gè)基因的表達(dá)均表現(xiàn)出莖>葉>根的趨勢(shì)[16]；蕪菁中CYP83A1的表達(dá)特性為葉>根>葉柄[13]。這與BoCYP83A1在青花菜CDBY-12的表達(dá)相似。

CYP83A1基因的表達(dá)能受外源激素所調(diào)控，如薺菜，在MeJA誘導(dǎo)下，除BjuCYP83A1-1表達(dá)變化不顯著，BjuCYP83A1-2、BjuCYP83A1-3和BjuCYP83A1-4表達(dá)均明顯上調(diào)；在SA誘導(dǎo)下，BjuCYP83A1-1、BjuCYP83A1-2、BjuCYP83A1-3和BjuCYP83A1-4等4個(gè)基因的表達(dá)均明顯下調(diào)[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MeJA噴施3 h后，青花菜BoCYP83A1表達(dá)水平顯著提高，6～9 h時(shí)表達(dá)量有所下降，但仍稍高于對(duì)照。SA噴施3 h后，BoCYP83A1表達(dá)水平顯著降低，在6 h時(shí)降低為對(duì)照的0.1倍，9 h則回升至對(duì)照水平。由此推測(cè)MeJA和SA也能夠調(diào)控青花菜BoCYP83A1的表達(dá)。

綜上所述，青花菜BoCYP83A1基因的表達(dá)與調(diào)控具有一定的保守性。后續(xù)研究將對(duì)BoCYP83A1基因的分子生物學(xué)功能進(jìn)行詳細(xì)解析，從而為培育高蘿卜硫素含量的青花菜新品種提供理論依據(jù)和基因資源。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression Analysis of Sulforaphane Synthesis-related GeneBoCYP83A1 in Broccoli

GAO Canhong1, DONG Lili1，GUAN Xiaowan1, ZHAO Liangxia1, LIN Juncheng2,

XU Fule2, ZHANG Shuiming1*

(1 Anhui Agricultural University, Hefei 230036，China; 2 Fuzhou Chaoda Modern Agriculture Development Co. Ltd., Fuzhou 350003，China)

CYP83A1 is a key gene in sulforaphane biosynthesis and metabolism. The full length ofBoCYP83A1 was obtained from broccoli CDBY-10 by the methods of RACE and RT-PCR.BoCYP83A1 was 1 509 bp in length, encoded a deduced protein of 502 amino acids, and contained the conserved P450 domain. The expression level ofBoCYP83A1 in different cultivars, tissues, or seedlings treated with different hormones was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. Phylogenetic tree analysis showed that BoCYP83A1 had the closest relationship withBrassicaoleraceavar.oleraceaBoCYP83A1. Tissue-specific expression ofBoCYP83A1 in cultivars was different: expression difference in CDBY-10 was small. It showed stem>leaf>root in CDBY-12，while root > stem > leaf in CDBY-14. The treatments of MeJA and SA led to the changes ofBoCYP83A1 expression：after the MeJA treatment，the expression ofBoCYP83A1 was raised to 1.9 times of the control, and then decreased a little; After the SA treatment，the expression ofBoCYP83A1 reduced quickly，and upto 0.1 time of the control at 6 h, then restored gradually to the expression level of control. The results indicated that the expression characteristics ofBoCYP83A1 in broccoli cultivars were different, andBoCYP83A1 expression can be regulated by MeJA and SA. Cloning and characterization ofBoCYP83A1 gene provide the theoretical basis for breeding new broccoli cultivars with high sulforaphane content.

broccoli; sulforaphane;BoCYP83A1; MeJA; SA

1000-4025(2016)07-1302-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1302

2016-04-25;修改稿收到日期:2016-05-25

國(guó)家自然科學(xué)基金(30900971)；安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)穩(wěn)定與引進(jìn)人才科研資助項(xiàng)目(YJ 2013-13)

高燦紅(1974-)，男，博士，主要從事蔬菜品質(zhì)生物技術(shù)研究。E-mail:gaocanhong@163.com

張水明，博士，副教授，主要從事園藝植物種質(zhì)資源與生物技術(shù)育種研究。E-mail:zhangshm893@sohu.com

Q785;Q786