李貴鳳，李　煌，劉　超

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論著

Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及成骨誘導(dǎo)實驗

李貴鳳，李煌，劉超

目的探討Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在體外進(jìn)行分離、純化以及定向誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的方法，為進(jìn)一步利用BMSCs移植治療骨組織缺損奠定基礎(chǔ)。方法體外分離培養(yǎng)BMSCs，并進(jìn)行定向的成骨誘導(dǎo)分化，采用茜素紅染色、Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色和免疫組化col-Ⅱ染色等方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果經(jīng)過體外分離培養(yǎng)的大鼠BMSCs在顯微鏡下為貼壁生長的成纖維樣細(xì)胞，其形態(tài)呈長梭形。經(jīng)過第一次傳代后的BMSCs形態(tài)趨于均一，呈漩渦樣或者菊花樣生長；傳代后在7 d內(nèi)BMSCs生長迅速，在7 d后細(xì)胞密度增加，出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象，而使細(xì)胞的生長速度減慢。經(jīng)定向誘導(dǎo)后BMSCs明顯表達(dá)為成骨表型。結(jié)論BMSCs是一種易于在體外分離培養(yǎng)和擴(kuò)增的細(xì)胞群，經(jīng)體外定向成骨誘導(dǎo)后的BMSCs具有典型的成骨細(xì)胞的形態(tài)和功能性特征，可以作為骨組織工程的種子細(xì)胞。

間充質(zhì)干細(xì)胞；成骨細(xì)胞；骨誘導(dǎo)；體外培養(yǎng)；大鼠

[Abstract]Objective To explore the approach to separate and purify Wistar rats'bonemarrow derived mesenchymal stem cells (BMSCs)in vitro and directionally induce osteoblast in order to provide a foundation for further use of BMSCs transplantation to treat bone defect disease.Methods BMSCs from Wistar ratswere isolated and cultured in vitro and directionally induced to osteoblastic differentiation.Identification was made through the methods of alizarin red staining and collagen typeⅠand col-Ⅱimmunohistochemical staining.Results The BMSCs separated and cultured in vitro presented long spindle-shaped fibroblast-like cellswith adherence growth under themicroscope.Themorphology of BMSCs after the first passage tended to be homogeneous with swirl or chrysanthemum like growth.Within 7 days after the passage,BMSCs showed rapid growth.Within 7 days after the passage, the cells grew fast,and the cell density increased after 7 days.Contact inhibition occurred which decreased the cell growth velocity. After the directional induction,BMSCs presented apparent osteogenous phenotype.Conclusion BMSCs can be easily isolated and multiplied in vitro.Those cellswhich were induced to osteoblastic differentiation present typical osteoblastmorphology and functional characteristics.Therefore,BMSCs are the ideal seed cells for the bone tissue engineering research.

[Key words]mesenchymal stem cell;osteoblast;bone induction;culture in vitro;rat

臨床上由于各種因素所致的骨及軟骨損傷、缺失極為常見。如果發(fā)生大面積的骨或骨-軟骨的大面積組織缺損，由于它們的自我再生修復(fù)能力有限，將會造成器官畸形及功能障礙，從而給患者的生理和心理上造成沉重的負(fù)擔(dān)[1-2]。而在機(jī)體的干細(xì)胞群中，有一類重要的細(xì)胞被稱為間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，MSCs來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細(xì)胞，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點，而日益受到人們的關(guān)注。在不同的條件下，可以誘導(dǎo)成機(jī)體不同的組織，而且MSCs在機(jī)體的骨髓及其組織器官中，如骨、軟骨、脂肪、內(nèi)皮、肌肉、神經(jīng)組織等終生存在，為組織器官修復(fù)和更新提供基礎(chǔ)[3]。近年來在組織工程骨-軟骨的構(gòu)建中，由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的自我復(fù)制和不同條件下誘導(dǎo)的多向分化能力，使其成為組織工程中首選的種子細(xì)胞[4]。BMSCs可以從脛骨、股骨、髂骨等部位取材，在這些部位取材方便，并且創(chuàng)傷較小，而且易于在體外分離及擴(kuò)增純化。BMSCs在有核細(xì)胞中數(shù)量較少，約為0.01%，但其有終生分化為骨或軟骨細(xì)胞的能力。本研究經(jīng)過分離、擴(kuò)增大鼠BMSCs，并將其在體外誘導(dǎo)向分化為成骨細(xì)胞，檢測其成骨活性,為下一步將BMSCs用于骨-軟骨組織工程學(xué)的研究打下基礎(chǔ)[5]。

1　材料與方法

1.1材料和儀器

1.1.1實驗材料α-MEM培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，Hepes、ITS、TGF-β1、β-甘油磷酸鈉(SIGMA公司)，兔抗鼠conagen-Ⅱ一抗、SABC免疫組化試劑盒（中衫試劑公司），其他試劑均為國產(chǎn)市售分析純；VS-1300-U型超凈工作臺，Olympus IX70倒置顯微鏡，Nikon TE2000-U倒置顯微鏡，二氧化碳培養(yǎng)箱。

1.1.2實驗動物新生3 d齡Wistar大鼠(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物合格證號2008001652989）24只，體重10 g。

1.2實驗方法

1.2.1Wistar大鼠BMSCs的分離與培養(yǎng)取3 d齡Wistar大鼠，斷頸脫臼處死，置于75%乙醇溶液消毒15 mins。無菌條件下分離出雙側(cè)股骨，剪斷股骨干骺端，暴露骨髓腔。以無血清DMEM液沖洗骨髓腔至流出液澄清；收集沖洗液，以1500 r/min離心10min；棄上清，加入DMEM條件培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素及100μg/m l鏈霉素)混懸。調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/m l，接種于75ml培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)；2 d后半量換液，以后每2～3 d全量換液1次。待細(xì)胞達(dá)80%以上融合后，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2Wistar大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)取傳代至第3代的BMSCs，消化、清洗后，以DMEM普通培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/m l，接種于6孔板內(nèi)，置37℃、5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長達(dá)50%融合時，更換為成骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)液（8～10 mol/L地塞米松、100 mg/ml雙抗、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10 mmol/L Vit C，10%血清）誘導(dǎo)培養(yǎng)，每72 h更換液體，每24 h在倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的變化以及培養(yǎng)液變化。

1.2.3成骨誘導(dǎo)茜素紅染色鑒定成骨誘導(dǎo)2 w后，對細(xì)胞爬片進(jìn)行茜素紅染色：將爬滿細(xì)胞的蓋玻片取出，4%多聚甲醛固定20min，在茜素紅染液中染色30min，雙蒸水沖洗，無水酒精脫色，二甲苯透明，封片，倒置顯微鏡下觀察。

1.2.4Ⅰ型膠原免疫組化染色檢測經(jīng)成骨誘導(dǎo)2 w后，取出6孔板中細(xì)胞爬片，PBS液漂洗，4%多聚甲醛固定，PBS漂洗5 min×3次，3%雙氧水中10 min，PBS 5 min×3次，封閉30 min，兔抗一抗4℃孵育過夜；PBS 5 min×3次，羊抗兔二抗37℃30min；PBS 5 min×3次，過氧化物酶標(biāo)記的鏈球菌親和素三抗37℃、30 min；PBS 5 min×3次，顯色、復(fù)染、脫水、封片。

1.2.5Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色(LSAB法)成軟骨誘導(dǎo)2 w后，對細(xì)胞爬片進(jìn)行Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色：棄去有細(xì)胞爬片的6孔板中的培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定，PBS漂洗5 min×3次，3%雙氧水中10min，PBS 5 min×3次，封閉30 min，兔抗一抗4℃孵育過夜；PBS 5 min×3次，羊抗兔二抗37℃、30min，PBS 5 min×3次，過氧化物酶標(biāo)記的鏈球菌親和素三抗37℃、30min，PBS 5min×3次，顯色、復(fù)染、脫水、封片。

2　結(jié)果

2.1BMSCs體外培養(yǎng)原代培養(yǎng)接種24 h后，即可見細(xì)胞貼壁生長，貼壁細(xì)胞多為短梭形或紡錘形；2～3 d可見細(xì)胞集落形成，集落中細(xì)胞形態(tài)為典型的梭形細(xì)胞；7～10 d后細(xì)胞進(jìn)入增殖高峰。經(jīng)過消化、離心、純化后，貼壁細(xì)胞多呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣或多角形狀態(tài)；隨細(xì)胞生長融合，細(xì)胞排列具有方向性，有時呈漩渦狀排列。

2.2BMSCs體外誘導(dǎo)成骨觀察BMSCs經(jīng)條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)2 w后，于倒置顯微鏡下觀察可見細(xì)胞呈短梭形或多角形，細(xì)胞可集落樣生長，集落區(qū)可見折光性結(jié)節(jié)若干，經(jīng)茜素紅染色呈紫紅色陽性（圖1），Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色陽性(圖2)。Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色時即可見陽性表達(dá)，聚集形成的結(jié)節(jié)呈強(qiáng)陽性表達(dá)，偶可在小結(jié)節(jié)看到均勻密布的胞膜胞外基質(zhì)陽性表達(dá)(圖3)。

圖1　BMSCs誘導(dǎo)14 d，茜素紅染色陽性(×100)

圖2　BMSCs誘導(dǎo)14 d，Ⅰ型膠原免疫組化染色陽性(SABC×200)

圖3　BMSCs誘導(dǎo)14 d，Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性(SABC×200)

3　討論

BMSCs是一類有多向分化潛能的干細(xì)胞，在一定環(huán)境和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，可以轉(zhuǎn)化成機(jī)體的各種細(xì)胞[6-9]。因其來源不受限，取材方便，對供體損傷小，易于分離培養(yǎng)，體外增殖能力強(qiáng)，且免疫原性低，具有多向分化潛能和良好的遷移性，是目前較為理想的骨組織工程種子細(xì)胞的來源。在本實驗中，我們沖洗Wistar大鼠股骨骨髓腔獲得全骨髓細(xì)胞，利用不同種類細(xì)胞貼壁時間差異篩選BMSCs，并利用消化傳代的反復(fù)貼壁法，并輔以DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)，而進(jìn)一步純化BMSCs。待細(xì)胞生長融合后，以成骨條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、組織化學(xué)染色及免疫組化等方法檢測細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMSCs經(jīng)過誘導(dǎo)2 w后，細(xì)胞可呈集落樣生長，集落區(qū)域可形成茜素紅染色陽性的礦化結(jié)節(jié)，而誘導(dǎo)后細(xì)胞經(jīng)Ⅰ型膠原免疫組化染色后呈陽性表達(dá)。這些結(jié)果表明，骨髓來源的MSCs經(jīng)純化培養(yǎng)后細(xì)胞增殖能力良好，而經(jīng)過成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，可以向成骨細(xì)胞方向分化，且具有一定的分泌和礦化能力。

本實驗證實了獲取的BMSCs具有多向分化能力，可作為后期實驗復(fù)合支架體外成骨與成軟骨的種子細(xì)胞[10-15]。

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Culture of rats'bonemarrow derivedmesenchymal stem cells in vitro and ossification induction experiment

Li Guifeng,Li Huang,Liu Chao Departments of Orthodontics,Affiliated Dental Hospital of Medical College,Nanjing University, Nanjing,Jiangsu,210000,China

RQ813.11/681

A

1004-0188（2016）03-0233-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.03.001

國家自然科學(xué)基金課題（81470712）

210000南京，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院正畸科

李煌，E-mail：49095530@qq.com

（2015-12-07）