哈志瑞，馬文有，沈春娟，沈泉，馬吉銀

（1.寧夏伊品生物科技股份有限公司，寧夏銀川750000；2.法國(guó)諾華賽分離技術(shù)上海有限公司，上海200000）

L-色氨酸色譜分離工藝中試研究

哈志瑞1，馬文有1，沈春娟2，沈泉2，馬吉銀1

（1.寧夏伊品生物科技股份有限公司，寧夏銀川750000；2.法國(guó)諾華賽分離技術(shù)上海有限公司，上海200000）

在與法國(guó)諾華賽聯(lián)合開發(fā)的L-色氨酸耦合分離工藝基礎(chǔ)上，通過中試放大研究，考察了L-色氨酸色譜分離工藝（順序式模擬移動(dòng)床色譜分離工藝（SSMB））參數(shù)，并與傳統(tǒng)離子交換工藝（IEX）做了對(duì)比分析。結(jié)果表明：采用SSMB優(yōu)化后工藝可以得到純度為82%～93%的色氨酸，且色氨酸收率達(dá)到99%以上。相對(duì)于IEX離交工藝，SSMB工藝得到的提取液色氨酸純度更高，NH4+含量更少，電導(dǎo)更低。

L-色氨酸；色譜分離；SSMB

目前國(guó)內(nèi)規(guī)?；a(chǎn)L-色氨酸的企業(yè)主要采用三膜法+離交工藝提取色氨酸，有的廠家仍使用傳統(tǒng)的活性炭脫色工藝［1-5］，此提取工藝最大的問題是產(chǎn)品收率低、廢水排放量大、各項(xiàng)單耗高、設(shè)備一次性投資大，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)L-色氨酸的生產(chǎn)成本高。色氨酸提取過程中常選用傳統(tǒng)離交工藝（IEX），使用001×7系列陽(yáng)離子交換樹脂對(duì)色氨酸進(jìn)行吸附、解析，從而達(dá)到提純的目的。該工藝主要缺點(diǎn)是樹脂對(duì)色氨酸吸附效率低，對(duì)無機(jī)鹽和其他雜酸基本無分離效果，且運(yùn)行過程中需要不斷進(jìn)行酸堿再生，增加了廢水排放量［6-7］。色譜分離技術(shù)（SSMB）通過混合物中各組分在色譜分離柱兩相間不斷進(jìn)行著的分配過程實(shí)現(xiàn)分離，是目前最有效的混合物分離分析方法。主要選用的樹脂有吸附樹脂，色譜分離技術(shù)能夠分離物化性能差別很小的化合物，當(dāng)混合物各組成部分的化學(xué)或物理性質(zhì)十分接近，其他分離技術(shù)很難或根本無法應(yīng)用時(shí)，色譜技術(shù)便顯示出優(yōu)越性，可以實(shí)現(xiàn)真正的連續(xù)、穩(wěn)態(tài)運(yùn)行［8］。

眾所周知，色譜分離技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室分析，隨著色譜技術(shù)的不斷進(jìn)步以及行業(yè)發(fā)展，使得大規(guī)模的色譜分離技術(shù)被廣泛應(yīng)用于石油化工、淀粉糖等產(chǎn)品的分離純化。通過不斷的探索和工藝革新，色譜工藝已經(jīng)具備節(jié)省樹脂用量、節(jié)省再生劑和洗滌水用量、工藝靈活性高、操作簡(jiǎn)單、投資費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，正被更多的行業(yè)所關(guān)注。伊品在與法國(guó)諾華賽聯(lián)合開發(fā)的L-色氨酸耦合分離工藝基礎(chǔ)上，采用新一代的SSMB色譜分離技術(shù)，配合篩選的最優(yōu)色譜樹脂YP-004，同時(shí)達(dá)到對(duì)色氨酸清液中無機(jī)鹽、糖及主要雜酸的有效分離，對(duì)后段色氨酸結(jié)晶工藝更為有利。本文通過中試放大研究，考察了L-色氨酸色譜分離工藝（SSMB）參數(shù)，并與傳統(tǒng)離交工藝（IEX）做了對(duì)比分析，確定L-色氨酸色譜分離工藝的工業(yè)化可行性。

1　材料與方法

1.1主要儀器與試劑

法國(guó)諾華賽SSMB 10-3 chromatography pilot plant中試系統(tǒng)（包含9根8 cm×120 cm色譜柱、樹脂裝填量730 mL及PLC自控系統(tǒng)），Agilent LC-1260 HPLC（安捷倫科技有限公司），Atago PAL-3糖度儀（日本愛拓），754紫外可見分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司），DDSJ-308A電導(dǎo)率儀、FE20 PH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），pH 6.00顯色液、1%色氨酸標(biāo)準(zhǔn)液（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.2方法

1.2.1色氨酸發(fā)酵液的制備

色氨酸發(fā)酵液通過三級(jí)發(fā)酵獲得，其工藝流程如下：凍管→斜面→一級(jí)搖瓶→二級(jí)種子罐→發(fā)酵罐發(fā)酵→色氨酸發(fā)酵液。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂粉20 g/L。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉7.5 g/L，KH2PO41.5 g/L，（NH4）2SO44 g/L，MgSO4·7H2O 3.15 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 75.6mg/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母浸粉1 g/L，KH2PO41.5 g/L，（NH4）2SO44 g/L，MgSO4·7H2O 3.15 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 75.6mg/L。

發(fā)酵條件為：37℃，250～550 r/min，通風(fēng)比為1～1.5 vvm，二級(jí)種子罐培養(yǎng)14 h左右，發(fā)酵罐培養(yǎng)32 h。

1.2.2色氨酸濃度測(cè)定

實(shí)驗(yàn)中色氨酸濃度測(cè)定基于HPLC分析后的外標(biāo)法所得。

HPLC條件：分析柱為YMC-Pack Pro C18S-5 μm，12 nm，4.6 mm×250 mm；流動(dòng)相A為1%乙酸溶液，10%甲醇，B為甲醇；洗脫速度為1 mL/ min；溫度為40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為UV 278 nm。

1.2.3其他指標(biāo)檢測(cè)

pH值：FE20 pH計(jì)；電導(dǎo)率：DDSJ-308A電導(dǎo)率儀在室溫下檢測(cè)；T430：754紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)430 nm處的透光值；色氨酸成品各項(xiàng)指標(biāo)按GB/T 25735-2010要求進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4色氨酸色譜分離流程

色氨酸發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜過濾后進(jìn)入色譜分離系統(tǒng)，色譜分離膜過濾流程如圖1所示。流程中所用色譜分離設(shè)備為NOVASEP公司提供。

如圖1所示：L-色氨酸色譜分離流程分為以下幾個(gè)步驟：第一步物料循環(huán)，無進(jìn)無出，間隙體積的移動(dòng)，同體積的物料在各柱內(nèi)置換；第二步進(jìn)料/吸附，物料由3區(qū)進(jìn)入柱內(nèi)，殘液由3區(qū)出料；第三步提取液收集/解吸，洗提液由1區(qū)進(jìn)入，提取液由1區(qū)收集（第二步和第三步同時(shí)進(jìn)行以提高產(chǎn)能，程序中會(huì)使2，3這兩步的生產(chǎn)時(shí)間相同，該步驟進(jìn)行時(shí)2區(qū)和4區(qū)無任何操作）；第四步殘液收集，洗提液由1區(qū)進(jìn)入，殘液由3區(qū)排出并收集（該步驟下，4區(qū)無任何操作），不同的區(qū)帶中色譜柱通過進(jìn)料口和出料口自動(dòng)閥切換。

2　結(jié)果與分析

2.1進(jìn)料數(shù)據(jù)分析

對(duì)連續(xù)六批實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，由表1及圖2的進(jìn)料分析可知：在經(jīng)過色譜分離系統(tǒng)的參數(shù)優(yōu)化后，對(duì)比分析色譜分離效果，取其中的連續(xù)六批次實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，進(jìn)料條件無明顯差異，對(duì)比結(jié)果可信度較高。

表1　進(jìn)料L-色氨酸數(shù)據(jù)分析

2.2提取液及殘液數(shù)據(jù)分析

針對(duì)以上六批次的進(jìn)料，對(duì)應(yīng)分析了經(jīng)色譜分離處理后的提取液及殘液數(shù)據(jù)，結(jié)果見表2、表3及圖3。由表2、表3及圖3可以看出：L-色氨酸膜濾清液經(jīng)色譜分離工藝處理后，提取液純度由39.68%提升至88.68%，電導(dǎo)率由10.89 ms/ cm下降到1.50 ms/cm，雜質(zhì)去除率達(dá)到90%以上。殘液中酸含量不到1%，主要富集大量鹽份和色素。色譜分離整體收率達(dá)到99%以上，相比傳統(tǒng)離交工藝提高5%以上。因色譜工藝使用更低濃度的氨水進(jìn)行洗脫，液氨消耗量比傳統(tǒng)離交工藝降低近一倍。此外，提取液pH更低可以減少后續(xù)脫氨能耗及HCL消耗，有利于提高一次結(jié)晶收率。

表2　L-色氨酸色譜提取液數(shù)據(jù)分析

2.3色譜提取液與離交收集液對(duì)比

由表4可知：SSMB色譜提取液與傳統(tǒng)的IEX離交收集液相比，具有更高的色氨酸純度及更低的鹽分和色度值。色氨酸含量略低于離交收集液，主要是為了避免產(chǎn)品在色譜柱中結(jié)晶析出。

2.4色譜提取液與離交收集液結(jié)晶對(duì)比

按照色氨酸結(jié)晶控制條件，對(duì)色譜提取液與離交收集液作結(jié)晶對(duì)比。其中，色譜提取液直接結(jié)晶，離交收集液經(jīng)脫色、調(diào)pH處理后結(jié)晶，結(jié)果如表5所示。

表3　L-色氨酸色譜殘液數(shù)據(jù)分析

表4　L-色氨酸色譜提取液與離交收集液數(shù)據(jù)對(duì)比

表5　L-色氨酸色譜提取液與離交收集液數(shù)據(jù)對(duì)比

通過上述實(shí)驗(yàn)可知，色譜提取液直接結(jié)晶成品符合色氨酸國(guó)標(biāo)要求，且各項(xiàng)指標(biāo)都優(yōu)于傳統(tǒng)離交工藝。一次結(jié)晶收率達(dá)到80.1%～82.6%，比傳統(tǒng)工藝的68.9%提升了近20%。

3　結(jié)論

根據(jù)SSMB中試實(shí)驗(yàn)研究，可以得到以下結(jié)論：1）通過SSMB色譜分離工藝，色氨酸提取液純度可以達(dá)到82%～93%，收率達(dá)到99%以上，比傳統(tǒng)離交工藝分別提高了近27%和5%；2）相對(duì)于IEX工藝，SSMB工藝使用更低的氨水濃度進(jìn)行洗脫，得到鹽分低、純度高的提取液，且色譜樹脂不用酸堿再生，減少了廢水的排放；3）SSMB色譜提取液無需調(diào)pH即可結(jié)晶，減少了HCl消耗，同時(shí)一次結(jié)晶收率比IEX離交工藝提高了近20%。

［1］蘇毅.發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸工藝優(yōu)化［D］.天津：天津科技大學(xué)，2013.

［2］梅叢笑.L-色氨酸提取工藝的研究［D］.天津：天津輕工業(yè)學(xué)院，2000.

［3］劉旭紅，賴新生.膜技術(shù)在色氨酸提取工藝的應(yīng)用［J］.發(fā)酵科技通訊，2010，39（1）：28-29.

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［5］葛方昕.L-色氨酸提取工藝的研究［D］.天津：天津輕工業(yè)學(xué)院，1999.

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

The application of L-tryptophan separation by SSMB technology

HA Zhirui1，MAWenyou1，ZHAO Chunguang1，SHEN Chunjuan2，SHEN Quan2，MA Jiyin1
（1.Ningxia Eppen Biotech Co.，Ltd.，Yinchuan 750000，China；2.Novasep Separation Technology Co.，Ltd.，Shanghai200000，China）

Based on the L-tryptophan chromatographic separation process which was jointly developed by France Novasep，the process parameters of L-tryptophan chromatographic separation in pilot scale were investigated，and a comparison with the traditional ion exchange process was alsomade.The results showed that L-tryptophan with a purity of 82%～93%was obtained by using the SSMB optimized process，and the yield reached 99%.Compared to IEX process，SSMB process resulted in higher L-tryptophan purity，less NH4+content and lower conductivity of extract.

L-tryptophan；chromatogram separate；SSMB

TQ92

A

1674-2214（2016）03-0165-05

2016-03-11

國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目（2014DFA31280）

哈志瑞（1982—），男，寧夏銀川人，工程師，碩士，研究方向?yàn)樯锘ぃ珽-mail：hazhirui8201@163.com.通信作者：馬吉銀，高級(jí)工程師，E-mail：majiyin@eppen.com.cn.