左勇，楊小龍，傅彬，葉碧霞，張晶（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

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桑椹果酒酵母GP2的發(fā)酵條件研究

左勇，楊小龍，傅彬，葉碧霞，張晶
（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

以桑椹果園土壤為分離源分離篩選桑椹果酒酵母，得到一株具有產(chǎn)香效果好，起酵快等優(yōu)點(diǎn)的酵母菌，最終將其命名為GP2。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)和方差分析，確定最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度26℃，SO2添加量為80 mg/L，糖添加量220g/L，接種量為0.9%。

桑椹果酒；酵母菌；單因素試驗(yàn)；正交試驗(yàn)；方差分析

桑椹又稱桑果，大多種類的桑果呈暗紫色，少數(shù)成乳白色。桑椹味美，深受人們的喜愛，享有“中華果王”之美譽(yù)［1］。桑椹含有種類豐富的有機(jī)酸，維生素以及人體缺少的礦物質(zhì)和微量元素，具有補(bǔ)肝益腎，補(bǔ)血養(yǎng)顏，改善生殖亞健康之功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，桑椹能阻斷體內(nèi)有害物質(zhì)的生成，提高酶的活性，增強(qiáng)抵抗力［2］。

桑椹是一種極易腐爛的水果，到了收獲季節(jié)，大量囤積的桑椹由于不能及時(shí)銷售，就容易浪費(fèi)掉，將新鮮的桑椹釀造成易保存的桑椹果酒，不但能提高桑椹帶來的經(jīng)濟(jì)效益，還能滿足市場對(duì)果酒的需求。目前，大多數(shù)果酒釀造多采用葡萄酒釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵，由于葡萄汁和桑椹果汁成分有顯著的差異［3］，以葡萄酒釀酒酵母釀出的桑椹果酒口感欠佳在所難免，缺乏自身特色。因此，采用適合釀造桑椹果酒的高專用酵母進(jìn)行桑椹果酒釀造，是解決這一課題的關(guān)鍵。當(dāng)前，不少科技工作者在從事桑椹果酒酵母的篩選及發(fā)酵條件的研究，由于切入點(diǎn)不同，所篩選出的酵母也不統(tǒng)一。

本試驗(yàn)以產(chǎn)香、產(chǎn)酒率以及起酵速度為出發(fā)點(diǎn)，篩選獲得了一株適用于發(fā)酵桑椹的釀酒酵母GP2，并從發(fā)酵溫度，SO2添加量，糖添加量和菌株接種量對(duì)酵母菌GP2的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究。

1　材料與方法

1.1材料

桑椹：購于內(nèi)江市威遠(yuǎn)縣；一級(jí)白砂糖：購于超市；菌種GP2：四川理工學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室篩選所得；對(duì)照菌為安琪釀酒高活性干酵母：安琪酵母伊犁有限公司。

1.2試劑與儀器

1.2.1試劑及培養(yǎng)基

活力大于等于500 000 U/g果膠酶（生化試劑）、硫酸鈉（分析純）、檸檬酸（分析純）、糖（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；虎紅瓊脂（生物試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；富集培養(yǎng)基：葡萄糖5%、KH2PO40.25%、尿素0.1%、酵母膏0.05%、MgSO40.1%、Fe2（SO4）30.01%、孟加拉紅（1%的水溶液）0.023%，121℃高壓滅菌15 min。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL、自然pH。

1.2.2儀器

恒溫恒濕箱HL MJ-250：上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司；電子天平AR1140：奧豪斯公司；可調(diào)溫電爐TW-2000W：成都市永興電器廠；立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；酸度計(jì)PHS-3C：奧豪斯儀器（上海）有限公司；手持糖度計(jì)：成都格納絲商貿(mào)有限公司；酒精計(jì)預(yù)制27000005-1：沈丘北郊玻璃儀器廠；榨汁機(jī)JYL-350：山東九陽小家電有限公司；光學(xué)顯微鏡XSP-1600X：廣州新怡光學(xué)顯微鏡廠家。

1.3方法

1.3.1工藝流程［4］

桑椹果實(shí)→選果→洗果→破碎打漿→成分調(diào)整（SO2，白砂糖，接種）→主發(fā)酵→分離→后發(fā)酵→初濾→調(diào)整→陳釀→澄清→精濾→裝瓶→殺菌

1.3.2單因素試驗(yàn)

影響果酒發(fā)酵的因素很多，本試驗(yàn)主要從溫度、糖添加量、SO2添加量以及接種量4個(gè)方面考慮。溫度選擇范圍：22℃到30℃之間，設(shè)置5個(gè)梯度。糖添加量：60 g/L到220 g/L，設(shè)置5個(gè)梯度。SO2添加量：40 mg/L到120 mg/L之間，設(shè)置5個(gè)梯度。接種量：0.5%到1.3%之間，設(shè)置5個(gè)梯度。通過單因素試驗(yàn)確定適宜的發(fā)酵溫度，糖添加量，SO2添加量以及接種量。

1.3.3正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定適宜的發(fā)酵溫度，SO2（亞硫酸鈉折算后）添加量，白砂糖添加量，接種量，根據(jù)這四因素設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)。

1.4分析測定方法［5］

酒精度：酒精計(jì)測定；糖度：手持糖量計(jì)測定；殘?zhí)牵红沉值味ǚy定（測定時(shí)將酒樣稀釋10倍可有效降低色素干擾）；酸度：pH計(jì)測定；感官評(píng)分：結(jié)合葡萄酒評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)以及桑椹果酒實(shí)際，制定感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1　桑椹果酒的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［2-6］Table 1　The scoring criteria of mulberry wine

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)［7］

2.1.1溫度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

在裝有300 mL桑椹果漿的5個(gè)錐形瓶中加入白砂糖140 g/L、添加SO260 mg/L，酵母菌GP2接入量為0.7%，然后發(fā)酵溫度分別在22、24、26、28、30℃條件下發(fā)酵8 d，結(jié)果如圖1。

圖1　不同溫度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.1　The effects of different temperature for fermentation results

由圖1可知，酵母菌GP2在26℃時(shí)產(chǎn)酒量最高，殘?zhí)橇孔畹?，而溫度較低或較高時(shí)酒精度不高，原因在于溫度太低或過高，會(huì)抑制酵母菌的生長繁殖及發(fā)酵，影響糖轉(zhuǎn)化為酒精，因此26℃為酵母菌GP2較適宜的發(fā)酵溫度。在后續(xù)的正交試驗(yàn)中，發(fā)酵溫度選擇在26℃附近進(jìn)行。

2.1.2SO2添加量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

在裝有300 mL桑椹果漿的5個(gè)錐形瓶中添加白砂糖140 g/L，酵母菌GP2接入量為0.7%，SO2添加量分別為40、60、80、100、120 mg/L，在26℃條件下發(fā)酵8 d，結(jié)果如圖2。

圖2　不同SO2添加量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.2　The effects of different amounts of SO2for fermentation results

添加適當(dāng)?shù)腟O2量，可有效的抑制發(fā)酵過程中雜菌的生長，使得釀酒酵母在發(fā)酵過程中占主體優(yōu)勢。由圖2可知，當(dāng)SO2的添加量高于或低于60 mg/L都會(huì)使產(chǎn)酒率下降，原因在于，SO2添加量過低，雜菌會(huì)在其中生長，將消耗部分糖類物質(zhì)，從而影響酒精含量；SO2添加量過高，將抑制到釀酒酵母自身的生長繁殖，從而也會(huì)影響到酒精度和殘?zhí)呛?。在后續(xù)的正交試驗(yàn)中，SO2添加量選擇在60 mg/L左右。

2.1.3糖添加量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

在裝有300mL桑椹果漿的5個(gè)錐形瓶中添加白砂糖分別為60、100、140、180、220g/L，添加SO2（60mg/L），再接入0.7%酵母菌GP2，在26℃條件下發(fā)酵8 d，結(jié)果如圖3。

圖3　不同白砂糖添加量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.3　The effects of different amounts of sugar for fermentation results

桑椹含有一定的糖分，但含量不高，若只用桑椹自身的含糖進(jìn)行發(fā)酵，酒精度較低，所以選擇在發(fā)酵過程中添加一定量的糖分。由圖3可知，當(dāng)糖添加量為180 g/L時(shí)酒精度達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值，當(dāng)添加量超過這一值時(shí)酒精度沒有什么顯著變化，但這一過程中殘?zhí)呛渴请S著糖添加量的增加而增加的。所以在后續(xù)的正交試驗(yàn)試驗(yàn)中為提高糖利用率，白砂糖的量選擇在180 g/L附近。

2.1.4酵母菌GP2接種量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

在裝有300 mL桑椹果漿的5個(gè)錐形瓶中添加白砂糖的量為140 g/L，SO2添加量為60 mg/L，酵母菌GP2接種量分別為0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%，在26℃條件下發(fā)酵8 d，結(jié)果如圖4。

圖4　不同酵母接種量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.4　The effects of different amounts of yeast for fermentation results

由于酵母菌的接種量可直接影響起酵和發(fā)酵速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵周期。由圖4可以出，當(dāng)酵母菌GP2接種量為0.9%時(shí)，酒精度產(chǎn)量較高。從整體上看，酵母菌的接種量達(dá)到0.9%以上后，對(duì)酒精度和殘?zhí)堑挠绊懖⒉皇呛艽蟆Ｔ诤罄m(xù)的正交試驗(yàn)中，酵母菌GP2接種量選擇為0.9%左右。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)以發(fā)酵溫度、SO2添加量、糖添加量、接種量為主要因素的正交試驗(yàn)，正交因素試驗(yàn)水平表見表2。正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析分別見表3和表4。

表2　L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表Table 2　The level form of orthogonal test factors

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3　The results of orthogonal test

表4　方差分析Table 4　The analysis of variance

表3中，酒精度權(quán)重［8］取30，感官評(píng)定權(quán)重取70。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果分析可知，在4個(gè)影響因素中，加糖量影響最大，其次是發(fā)酵溫度，再次是接種量，最后是SO2的添加量。由方差分析表4可知，糖添加量和發(fā)酵溫度對(duì)桑椹果酒的發(fā)酵有顯著的影響，而接種量和SO2添加量影響較弱，最后確定最佳組合為A2B3C3D2，即發(fā)酵溫度26℃，SO2添加量為80 mg/L，糖添加量220 g/L，接種量為0.9%。

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)［9］

對(duì)確定的組合A2B3C3D2進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，重復(fù)3次。最終的試驗(yàn)結(jié)果均優(yōu)于正交試驗(yàn)中其他組，其酒精度平均值為10.7%vol，達(dá)到了果酒的酒精度一般在7%vol～13%vol之間的指標(biāo)［10］。感官評(píng)分平均分87，證明正交試驗(yàn)得出的最佳工藝條件是穩(wěn)定可靠的，在最優(yōu)條件下，最終發(fā)酵結(jié)果與安琪釀酒酵母相比，除酒精度略低于安琪釀酒酵母（安琪釀酒酵母發(fā)酵后酒精度為10.9%vol）外，其余感官指標(biāo)與安琪釀酒酵母差別不大，在桑椹果酒芳香味方面GP2發(fā)酵結(jié)果更為突出。

3　結(jié)論

本研究從發(fā)酵溫度，SO2添加量，糖濃度，酵母接種量4個(gè)方面對(duì)酵母菌GP2發(fā)酵條件進(jìn)行了單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，并通過方差分析，確定了桑椹果酒酵母GP2的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度26℃，SO2添加量為80 mg/L，糖添加量220 g/L，接種量為0.9%。從最終的發(fā)酵結(jié)果看，酵母菌GP2適合桑椹果酒產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，可以替代傳統(tǒng)葡萄酒酵母進(jìn)行的桑椹果酒發(fā)酵。

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Studies on Fermentation Conditions of the Yeast GP2 for Mulberry Wine

ZUO Yong，YANG Xiao-long，F(xiàn)U Bin，YE Bi-xia，ZHANG Jing
（College of Bioengineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

A yeast strain for mulberry wine was isolated and screened from mulberry orchard soil，and this strain has advantages of effectively producing fragrance and rapid fermentation.Eventually，it was named as yeast strain GP2.The optimal conditions were determined on the base of single factor experiments，orthogonal tests and variance analysis，the results as follows：26℃fermentation temperature，SO280 mg/L，sucrose 220 g/L and inoculation 0.9%.

mulberry wine；yeast；single factor experiments；orthogonal tests；variance analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.022

2015四川省重大成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（2014年獲四川省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)）

左勇（1972—），男（漢），教授，碩士，研究方向：發(fā)酵食品。

2015-06-28