魏增云，張海容，陳金娥（.山西省忻州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西忻州034000；.山西省忻州師范學(xué)院生化分析技術(shù)研究所，山西忻州034000）

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響應(yīng)面優(yōu)化-微波輔助提取吳茱萸多糖工藝

魏增云1，張海容2，陳金娥2
（1.山西省忻州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西忻州034000；2.山西省忻州師范學(xué)院生化分析技術(shù)研究所，山西忻州034000）

利用微波輔助技術(shù)進(jìn)行吳茱萸多糖提取，通過單因素試驗(yàn)確定因素與水平。在其基礎(chǔ)上，依據(jù)響應(yīng)面分析法研究了微波功率、提取時間、提取次數(shù)和液料比對吳茱萸多糖提取率的影響，確定微波提取吳茱萸多糖的最佳工藝參數(shù)為：微波功率390W、提取時間為101s、提取次數(shù)2次、料液比為103∶1（mL/g）。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)測定多糖提取率為21.01%，與預(yù)測的最大響應(yīng)值（吳茱萸多糖提取率為21.90%）的相對偏差為4.06%。

微波輔助提?。豁憫?yīng)面法；吳茱萸多糖

吳茱萸（Tetradium ruticarpum）為蕓香科植物，落葉灌木或小型喬木。中藥材吳茱萸為吳茱萸將近成熟的果實(shí)曬干，具有健脾和胃、散寒止痛、疏肝下氣、燥濕止瀉之功效［1］，還用于咽喉腫痛、口舌生瘡［2］、高血壓、心血管等病癥的治療［3-5］，《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載為中藥中品。吳茱萸有兩千年的人工種植栽培歷史，分布于我國中部、南部多省份，如四川、貴州、廣西、湖南等［6］。吳茱萸富含生物堿、揮發(fā)油、吳茱萸烯、多糖等多種有效成分。

多糖是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖類，有均一性和不均一性兩種。近年來，植物多糖受到了醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛重視［7-8］，具有抗氧化性、抑制腫瘤、抗輻射及免疫功能［9-10］。微波提取技術(shù)優(yōu)點(diǎn)突出，易實(shí)施、易操作、節(jié)時節(jié)能無污染，微波作用幾分鐘的提取效果與傳統(tǒng)方式提取幾個小時的效果等同［11］。近年來微波提取發(fā)展迅速，已廣泛應(yīng)用于食品、化工和中藥提取等領(lǐng)域。該研究采用微波輔助對吳茱萸多糖進(jìn)行提取并對影響吳茱萸多糖含量的幾個重要因素進(jìn)行了響應(yīng)面分析，并優(yōu)化了其工藝條件，以期為工業(yè)化提取吳茱萸多糖提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

吳茱萸購自忻州當(dāng)?shù)厮幍辏?5℃恒溫干燥3 h，粉碎后過40目篩待用。

D（+）-無水葡萄糖（分析純）、濃硫酸（分析純）：天津耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；苯酚（分析純）：中國醫(yī)藥公司天津公司。

SP-723紫外可見光風(fēng)光光度計(jì)：上海光譜；微電腦微波化學(xué)反應(yīng)器LWMC-201：南京陵江科技開發(fā)有限責(zé)任公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華責(zé)任公司；AB204-N型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用移液管準(zhǔn)確量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL的100 μg/mL的葡萄糖工作液于7支10 mL比色管中，補(bǔ)水到2 mL，加5%的苯酚溶液各1 mL，搖勻，迅速再加98%的濃硫酸各5 mL，標(biāo)定至10 mL，沸水浴中煮沸15 min，冷水中冷卻。在最大吸收波長490 nm處，以試劑空白作參比，測定吸光值，并以吸光值為縱坐標(biāo)，濃度c（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線和擬合方程如圖1所示。

多糖提取液的濃度（μg/mL）

圖1　葡糖糖工作曲線Fig.1　Work curve of glucose

1.2.2吳茱萸多糖的提取和測定

準(zhǔn)確稱取0.2 g吳茱萸粉末，利用二次水作為提取試劑，設(shè)定微波提取功率、提取時間、提取次數(shù)和液料比進(jìn)行微波處理，抽濾得到的多糖濾液，定容到25 mL比色管。進(jìn)行梯度稀釋后，準(zhǔn)確吸取1 mL多糖提取液，加入1 mL 5%的苯酚，搖勻后迅速加入5 mL濃硫酸，標(biāo)定至10 mL，沸水浴中煮沸15 min，冷水中冷卻后，在490 nm處測定其吸光值，計(jì)算多糖提取率。

1.2.3多糖提取單因素試驗(yàn)

微波功率對多糖提取率的影響：準(zhǔn)確稱取吳茱萸粉0.2 g，在液料比為60∶1（mL/g）條件下，采用不同微波功率（130、260、390、520、680 W）處理90 s，提取兩次，考察不同微波功率對多糖提取率的影響；微波輻射時間對多糖提取率影響：準(zhǔn)確稱取吳茱萸粉0.2 g，在已優(yōu)化條件微波功率390 W，液料比60∶1（mL/g）條件下，不同微波輻射時間（30、60、90、120、150 s）提取兩次，考察不同微波輻射時間對多糖提取率的影響；液料比對多糖提取率影響：準(zhǔn)確稱取吳茱萸粉0.2 g，在已優(yōu)化條件微波功率390 W、微波輻射時間120 s條件下，不同液料比（30∶1、60∶1、90∶1、120∶1、150∶1，mL/g）提取兩次，考察不同液料比對多糖提取率的影響；提取次數(shù)對多糖提取率影響：準(zhǔn)確稱取吳茱萸粉0.2 g，在已優(yōu)化條件微波功率390 W、微波輻射時間120 s、液料比60∶1（mL/g）條件下，考察不同提取次數(shù)（1、2、3、4、5）對多糖提取率的影響。

1.2.4響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取微波時間（X1）、液料比（X2）、微波功率（X3）3個考察因素，應(yīng)用DesignExpert 7 Docoument軟件設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法，根據(jù)表1設(shè)定的試驗(yàn)因素和水平，以吳茱萸多糖提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，并利用響應(yīng)面法對吳茱萸多糖微波提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1　微波輔助提取吳茱萸多糖試驗(yàn)因素、水平及編碼Table 1　Codes and levels of factors of microwave assisted extraction of Evodia polysaccharide

2　結(jié)果與討論分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1微波功率對多糖提取率的影響

不同微波功率對吳茱萸多糖提取效果的影響見圖2。

圖2　不同微波功率對吳茱萸多糖提取效果的影響Fig.2　Effect of different microwave power on extraction rate of evodia polysaccharide

由圖2可知，隨著微波功率升高，多糖提取率逐漸升高，當(dāng)微波功率達(dá)到260 W～650 W時提取率不再升高?？紤]到微波功率與其它條件交互影響時可留有更加優(yōu)化的空間，選擇390 W為最適宜微波功率條件。

2.1.2微波輻射時間對吳茱萸多糖提取率的影響

不同微波時間對吳茱萸多糖提取效果的影響見圖3。

圖3　不同微波時間對吳茱萸多糖提取效果的影響Fig.3　Effect of different microwave time on extraction rate of evodia polysaccharide

由圖3可知，隨著微波輻射時間的增加，多糖提取率明顯升高，120 s時達(dá)到最高。繼續(xù)延長時間提取率并無明顯變化。因此，選擇微波輻射時間120 s為最佳微波輻射時間條件。

2.1.3料液比對吳茱萸多糖提取率的影響

不同液料比對吳茱萸多糖提取效果的影響見圖4。

圖4　不同液料比對吳茱萸多糖提取效果的影響Fig.4　Effect of the liquid-solid ratio on extraction rate of evodia polysaccharide

由圖4可知，隨著料液比的增大多糖提取率也逐漸增大，當(dāng)料液比增大到1∶60（g/mL）時，之后繼續(xù)增大再無明顯變化。因此確定最佳料液比條件為1∶60（g/mL）。

2.1.4提取次數(shù)對吳茱萸多糖提取率的影響

不同提取次數(shù)對吳茱萸多糖提取效果的影響見圖5。

由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增加，多糖得率依次升高，但2次后雖有升高但并不明顯?？紤]到工藝成本等因素選擇提取2次為最佳提取次數(shù)條件。

2.2響應(yīng)面法對微波提取吳茱萸多糖提取條件的優(yōu)化

2.2.1模型建立與顯著性檢驗(yàn)

圖5　不同提取次數(shù)對吳茱萸多糖提取效果的影響Fig.5　Effect of different extraction times on eth extraction rate of evodia polyaccharide

以X1、X2、X3為自變量，以吳茱萸多糖吸光值為響應(yīng)值、采用Design-Exper軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)方法［12-14］對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合。析因試驗(yàn)1～12號，中心試驗(yàn)13號～17號。析因點(diǎn)和零點(diǎn)為17個試驗(yàn)點(diǎn)，析因點(diǎn)為自變量取值構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；零點(diǎn)為中心點(diǎn)。試驗(yàn)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2　微波輔助提取吳茱萸多糖試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2　Microwave-assisted extraction evodia polysaccharide experimental design and results

為了表明各因素對響應(yīng)值Y的影響關(guān)系，采用DesignExpert 7 Docoument軟件對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，建立回歸模型，求的到如下回歸方程。

Y=0.56+0.044X1+0.038X2+0.036X3+0.043X12-0.024X22-0.036X32+0.005X1X2+0.003X1X3+0.031X2X3

回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)（表3）可以看出，X1X2、X1X3、X22的P值大于0.05，為不顯著項(xiàng)，其余各項(xiàng)均顯著。為了進(jìn)一步確證最佳點(diǎn)的取值，對回歸方程取一階偏導(dǎo)等于零數(shù)并整理得：0.044+0.005 X2+0.003 X3+0.086 X1=0

0.038+0.005 X1+0.031 X3-0.048 X2=0

0.036+0.003 X1+0.031 X2-0.072 X3=0

求解方程得到：X1=-0.633，X2=1.429，X3=1.089

即：提取時間、液料比、微波功率分別為101 S、102.87∶1（mL/g）、401.57W，實(shí)際生產(chǎn)情況下，提取時間、液料比、微波功率可分別修正為101 S、103∶1（mL/g）、390 W為最佳生產(chǎn)工藝參數(shù)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證吳茱萸多糖最優(yōu)的微波輔助提取工藝，采用上述條件進(jìn)行了3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果吳茱萸多糖提取液的吸光值均達(dá)到了0.570±0.003（即提取率為21.01%）與0.592理論值（即提取率為21.90%）基本一致，與預(yù)測的最大響應(yīng)值的相對偏差為4.06%。

表3　回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Table 3　Significance test for regression coefficient

回歸模型的方差分析（表4）可以看出，該模型的確定系數(shù)R2=0.936 7，說明該模型能夠解釋93.67%的變化，方程模型顯著性P=0.004 1，表明該回歸方程的擬合度良好。可以很好解釋模型的變化，試驗(yàn)誤差小，自變量與響應(yīng)值線性關(guān)系顯著，可以用于吳茱萸多糖微波提取實(shí)驗(yàn)的理論預(yù)測。

表4　回歸模型方差分析表Table 4　Analysis of variance for regression equation

2.2.2吳茱萸多糖提取率的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸分析結(jié)果作出響應(yīng)曲面如圖6～圖8。

圖6　微波功率和時間對提取液中吳茱萸多糖吸光值影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.6　Response surface and contour line for the effect of microwave power and time on absorption of evodia polysaccharide

圖7　微波提取時間和液料比對提取液中吳茱萸多糖吸光值影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.7　Response surface and contour line for the effect of extraction time and the ratio of liquid to solid on absorption of evodia polysaccharide

圖8　微波功率和液料比對提取液中吳茱萸多糖吸光值影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.8　Response surface and contour line for the effect of power and the ratio of liquid to solid on absorption of evodia polysaccharide

從圖6～圖8可以看出，多糖提取率存在極大值，即響應(yīng)面的最高點(diǎn)由DesignExpert 7 Docoument軟件分析可得最大響應(yīng)值為0.592（即提取率為21.90%），提取時間、液料比、微波功率分別為101 s、102.87∶1（mL/g）、401.57 W，為了驗(yàn)證響應(yīng)面的可行性，采用所得到的優(yōu)化條件進(jìn)行吳茱萸多糖提取的驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明提取時間、液料比、微波功率分別修正為101 s、103∶1（mL/g）、390 W時，多糖提取率為21.01%，與預(yù)測的最大響應(yīng)值的相對偏差為4.06%。

3　結(jié)論

通過DesignExpert 7 Docoument軟件設(shè)計(jì)的響應(yīng)面分析法，能夠可靠地進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)以及數(shù)據(jù)處理，試驗(yàn)應(yīng)用這一方法對吳茱萸多糖提取的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。

在單因素的基礎(chǔ)上應(yīng)用DesignExpert 7 Docoument軟件設(shè)計(jì)三因素三水平的試驗(yàn)，確定出了吳茱萸多糖提取的優(yōu)化工藝條件為：提取時間101 s、提取次數(shù)2次、液料比102.87∶1（mL/g）、微波功率401.57 W。多糖提取率高達(dá)21.90%，修正條件后，驗(yàn)證試驗(yàn)提取率相對偏差并不大，試驗(yàn)研究的最優(yōu)的工藝參數(shù)可靠，指導(dǎo)實(shí)踐生產(chǎn)可行。

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Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Polysaccharides from Evodia with Response Surface Methodology

WEI Zeng-yun1，ZHANG Hai-rong2，CHEN Jin-e2
（1.College of Xinzhou Occupation Technology，Xinzhou 034000，Shanxi，China；2.Institute of Biochemical Analysis，Xinzhou Teachers'College，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

The extraction of polysaccharide of evodia with microwave-assisted method，the factors and levels were determined through single factor experiment.The effects of microwave power，extraction time，extraction times and material-liquid ratio on extraction rates of ERP were studied based on of single factor experiment with response surface methodology.The optimum conditions for the extraction polysaccharides of evodia were as follows：390 W of microwave power，101 s of extraction time，twice for extraction times and the material-liquid ratio of 103∶1（mL/g）.Under this condition，the model predictive and experimental value of evodia polysaccharides yield were 21.90%and 21.01%，respectively.The relative standard deviation was 4.06%.

microwave-assisted extraction；the response surface method；polysaccharide of evodia

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.010

山西省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新項(xiàng)目資助（20141120）；忻州師范學(xué)院物理化學(xué)重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目（XK201402）

魏增云（1975—），男（漢），副教授，碩士，主要從事植物成分分離分析方向研究。

2015-07-24