陶東婭，金銀旗（.臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院機(jī)電工程學(xué)院，浙江臺(tái)州38000；.臺(tái)州市光躍飲水設(shè)備有限公司，浙江臺(tái)州3800）

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不同地區(qū)粘豆包酸面團(tuán)中微生物多樣性分析

陶東婭1，金銀旗2
（1.臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院機(jī)電工程學(xué)院，浙江臺(tái)州318000；2.臺(tái)州市光躍飲水設(shè)備有限公司，浙江臺(tái)州318020）

本研究以采集自黑龍江不同縣的粘豆包酸面團(tuán)為研究對(duì)象，利用變性梯度凝膠電泳和基因測(cè)序技術(shù)對(duì)上述樣品中的細(xì)菌和真菌的多樣性進(jìn)行揭示。結(jié)果表明：在4種樣品中細(xì)菌的多樣性高于真菌，并發(fā)現(xiàn)了7種不同的細(xì)菌菌種，4個(gè)不同的真菌菌種，其中以乳桿菌屬中的微生物最為豐富。通過不同地區(qū)樣品多樣性的比較發(fā)現(xiàn)：粘豆包酸面團(tuán)中微生物的多樣性與收集地之間存在一定的聯(lián)系。

粘豆包酸面團(tuán)；微生物多樣性；變形梯度凝膠電泳；基因測(cè)序

傳統(tǒng)粘豆包是利用自然環(huán)境中天然野菌種進(jìn)行發(fā)酵后包裹紅豆餡蒸制而成的冷凍類傳統(tǒng)自然發(fā)酵食品，產(chǎn)品色澤亮黃、粘稠筋道、營(yíng)養(yǎng)豐富，且礦物質(zhì)等能在酸化過程中被充分的吸收利用［1-2］。在粘豆包的制作過程中，粘豆包酸面團(tuán)的自然發(fā)酵是最重要的環(huán)節(jié)之一，同時(shí)正是因?yàn)橐揽刻烊话l(fā)酵，所以粘豆包酸面團(tuán)的風(fēng)味和品質(zhì)具有很強(qiáng)的地域特色［3-4］。

粘豆包酸面團(tuán)的自然發(fā)酵主要是細(xì)菌和真菌的發(fā)酵，楊健等對(duì)黑龍江省肇州縣的粘豆包酸面團(tuán)進(jìn)行了細(xì)菌多樣性的研究，初步揭示了其細(xì)菌的多樣性［5］。Tingtao Chen等研究了不同原料和配比對(duì)粘豆包酸面團(tuán)中微生物組成的影響，發(fā)現(xiàn)相比單一谷物的酸面團(tuán)，混合配比的酸面團(tuán)的微生物多樣性更為豐富，且主要的菌屬為乳酸菌和酵母菌［6］。本研究在上述研究的基礎(chǔ)上，采集了黑龍江省不同地區(qū)的粘豆包酸面團(tuán)（大黃米面∶玉米面=3∶1，質(zhì)量比），對(duì)其進(jìn)行了細(xì)菌和真菌的多樣性分析，以期全面揭示黑龍江地區(qū)粘豆包酸面團(tuán)微生物的組成結(jié)構(gòu)，并闡述粘豆包酸面團(tuán)微生物多樣性與地域之間的關(guān)系，為開發(fā)工業(yè)化的粘豆包發(fā)酵劑提供理論參考。

1　材料與儀器

1.1主要材料

1.1.1樣品來(lái)源

本試驗(yàn)采用的粘豆包酸面團(tuán)均采購(gòu)自不同地區(qū)的農(nóng)民家庭，這些地區(qū)分別為：黑龍江省牡丹江市東寧縣、黑龍江省哈爾濱市賓縣、黑龍江省雙鴨山市寶清縣和黑龍江省綏化市青岡縣，這些樣品的主要原料均為大黃米面和玉米面，比例均為3∶1（質(zhì)量比），并分別編碼為樣品A、B、C和D。

1.1.2主要試劑

細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒、真菌DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix（含染料）、D2000，上述生物試劑均購(gòu)買自北京天根生化科技有限公司；無(wú)水乙醇：山東紫翔化工銷售有限公司；瓊脂糖：南京生興生物；丙烯酰胺：濟(jì)南智恒致遠(yuǎn)化工科技有限公司；雙丙烯酰胺：濟(jì)南智恒致遠(yuǎn)化工科技有限公司；冰醋酸：保定市百運(yùn)化工有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）：保定市百運(yùn)化工有限公司；尿素：保定市百運(yùn)化工有限公司；去離子甲酰胺：上海酶聯(lián)生物研究所；四甲基乙二胺（TEMED）：上海博谷生物；過硫酸銨：濟(jì)南世紀(jì)通達(dá)化工有限公司；硝酸銀：廣州市鑫鉑化工有限公司；甲醛：青州市恒興化工有限公司。

1.2試驗(yàn)儀器

TCL16G離心機(jī)：上海姚氏儀器設(shè)備廠；PL203型電子分析天平：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；水浴鍋：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DYY-10C型電泳儀：北京市六一儀器廠；變性梯度凝膠（DGGE）電泳儀：美國(guó)Bio-Rad公司。

2　方法

2.1樣品DNA的提取

根據(jù)楊健等［5］的報(bào)道制備粘豆包酸面團(tuán)的懸浮液，之后按照細(xì)菌DNA提取試劑盒和真菌提取試劑盒說明書提取樣品中細(xì)菌和真菌的DNA。

2.2DNA的PCR擴(kuò)增

以樣品細(xì)菌的DNA為模板，引物采用細(xì)菌16S rRNA V3區(qū)引物BA338f-GC和UN518r，引物序列和擴(kuò)增條件如費(fèi)鵬等的報(bào)道［7］。以樣品真菌DNA為模板，引物采用真菌26S rRNA D1/D2區(qū)引物NL1-GC和LS2，引物序列和擴(kuò)增條件如姚笛等的報(bào)道［8］。

2.3變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）分析

細(xì)菌DNA擴(kuò)增的DGGE分析采用35%～60%的變性凝膠梯度電泳，上樣量為30 μL、反應(yīng)溫度為60℃、電壓130 V、電泳8 h；真菌DNA擴(kuò)增的DGGE分析采用35%～70%的變性梯度，上樣量為30 μL、反應(yīng)溫度為60℃、電壓120 V、電泳9 h。電泳后將DGGE膠用去離子水清洗，之后采用張巧云等［9］的方法對(duì)膠體進(jìn)行銀染，并用相機(jī)進(jìn)行拍照。

2.4基因測(cè)序分析

對(duì)膠體中的條帶進(jìn)行切膠，并用清水進(jìn)行清洗，搗碎，加入50 μL去離子水，在4℃冰箱過夜，以上清液為模板，采用沒有GC夾的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后將PCR產(chǎn)物送往蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。將基因測(cè)序結(jié)果在GENBANK數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，對(duì)菌株進(jìn)行定性分析。

3　結(jié)果與分析

3.1粘豆包酸面團(tuán)DNA樣品PCR擴(kuò)增

用1%的瓊脂糖凝膠電泳分別對(duì)粘豆包酸面團(tuán)細(xì)菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物和真菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。

圖1　不同地區(qū)樣品DNA擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1　Amplification product of DNA of samples from different region

圖1（a）中，4個(gè)樣品的細(xì)菌DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的目的條帶都在200 bp左右，條帶清晰均一，可以認(rèn)定細(xì)菌16S rRNA V3區(qū)的PCR產(chǎn)物。圖1（b）中，4個(gè)樣品的真菌DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的目的條帶都在250 bp左右，條帶清晰均一，可認(rèn)定為真菌26S rRNA D1/D2區(qū)的目的條帶。因此上述PCR產(chǎn)物均可用于后續(xù)的DGGE分析。

3.2不同地區(qū)粘豆包酸面團(tuán)細(xì)菌多樣性分析

利用DGGE電泳技術(shù)分析不同地區(qū)粘豆包酸面團(tuán)中細(xì)菌的多樣性，結(jié)果如圖2所示。

在4個(gè)樣品中共發(fā)現(xiàn)了7個(gè)不同位置的條帶，這說明在粘豆包酸面團(tuán)中細(xì)菌的多樣性較為豐富，且4個(gè)來(lái)自不同地區(qū)的樣品中細(xì)菌多樣性也存在著一定差異。此外，樣品B（哈爾濱市賓縣）和樣品D（綏化市青岡縣）的DGGE圖譜比較接近，這兩個(gè)樣品分別來(lái)自哈爾濱市賓縣和綏化市的青岡縣，樣品C（雙鴨山市寶清縣）的DGGE圖譜與其他3個(gè)樣品有明顯的差距，這可能是因?yàn)檎扯拱崦鎴F(tuán)是天然發(fā)酵的食品，其中的微生物組成與地域有一定的聯(lián)系，在地理位置上樣品B和樣品D比較接近，而樣品C在地理位置上遠(yuǎn)離其他3個(gè)樣品。

圖2　不同地區(qū)樣品細(xì)菌DGGE圖譜Fig.2　DGGE profile of the bacteria of DNA of samples from different regions

將7個(gè)不同的條帶進(jìn)行膠回收、PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如表1所示。

表1　不同地區(qū)樣品細(xì)菌和真菌DGGE圖譜中條帶Blast對(duì)比結(jié)果Table 1　Blast result of bands in DGGE profiles of bacteria and fungi of samples from different regions

7個(gè)條帶代表了7個(gè)不同的菌種，分別為：植物乳桿菌（Lactococcus fermentum）、檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）、羅伊氏乳桿菌（L.reuteri）、食竇魏斯氏菌（Weissella.cibaria）、乳酸乳球菌（L.lactis）、短乳桿菌（L.brevis）和融合魏斯氏菌（Weissella confusa），其中代表植物乳桿菌、檸檬明串珠菌和短乳桿菌的條帶雖然亮度不一，但是這些菌都出現(xiàn)了4個(gè)粘豆包酸面團(tuán)樣品中。羅伊氏乳桿菌和食竇魏斯氏菌只出現(xiàn)在了樣品B和樣品C中，融合魏斯氏菌只出現(xiàn)在了樣品C中。

3.3不同地區(qū)粘豆包酸面團(tuán)真菌多樣性分析

利用DGGE電泳技術(shù)分析不同地區(qū)粘豆包酸面團(tuán)中真菌的多樣性，結(jié)果如圖3所示。

圖3　不同地區(qū)樣品真菌DGGE圖譜Fig.3　DGGE profile of the fungi of DNA of samples from different regions

在4個(gè)樣品中共發(fā)現(xiàn)了4個(gè)不同位置的條帶，可見粘豆包酸面團(tuán)真菌的多樣性低于細(xì)菌的多樣性。在4個(gè)來(lái)自不同地區(qū)的樣品中，樣品A（牡丹江市東寧縣）的真菌條帶最多。分析原因，牡丹江市東寧縣位于黑龍江省的最南邊，真菌的多樣性很可能與當(dāng)?shù)氐臏囟葰夂蛴嘘P(guān)。通過基因測(cè)序分析（表1）可知：4個(gè)不同的條帶分別代表：米根霉（Rhizopus oryzae）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和異常畢赤酵母（Pichia anomala）。其中米根霉只在樣品A中出現(xiàn)，異常畢赤酵母只在樣品B（哈爾濱市賓縣）中出現(xiàn)。

4　討論

在采集自黑龍江省不同縣的粘豆包酸面團(tuán)中，細(xì)菌的多樣性高于真菌的多樣性，且在細(xì)菌中以乳桿菌屬為優(yōu)勢(shì)的菌屬，這一研究結(jié)果與Liu T等的發(fā)現(xiàn)一致［10］。在4份樣品中，植物乳桿菌、檸檬明串珠菌、熱帶假絲酵母和釀酒酵母均被檢測(cè)到且條帶顏色較深，這說明上述微生物在粘豆包酸面團(tuán)的發(fā)酵過程中發(fā)揮了重要的作用，而在Zhang G等的研究也證明了上述結(jié)果［4］。此外，在個(gè)別的樣品中羅伊氏乳桿菌、食竇魏斯氏菌、乳酸乳球菌、短乳桿菌、融合魏斯氏菌、米根霉、異常畢赤酵母也被發(fā)現(xiàn)，這些微生物都具有一定的發(fā)酵能力，能夠產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味和口感。上述結(jié)果啟發(fā)我們可以利用上述發(fā)酵微生物的混合物作為發(fā)酵劑應(yīng)用于粘豆包的工業(yè)生產(chǎn)中，而發(fā)酵微生物的種類和配比還需進(jìn)一步的研究。

同時(shí)，我們分析了不同地區(qū)粘豆包酸面團(tuán)中微生物的多樣性，發(fā)現(xiàn)粘豆包酸面團(tuán)中微生物的多樣性及微生物種類與樣品采集地點(diǎn)具有一定的聯(lián)系。在采集地較近的樣品中細(xì)菌多樣性較近，在較北的雙鴨山寶清地區(qū)細(xì)菌的種類明顯與其他3個(gè)樣品不同，而在溫度較高的牡丹江東寧地區(qū)真菌的多樣性較高，且組成與其他地區(qū)不同。在楊健等［5］的研究中，樣品采集地為黑龍江省肇州縣，主要的菌株有地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、發(fā)酵乳桿菌、短乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和醋化醋桿菌等，其中地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和醋化醋桿菌在我們的研究中并沒有發(fā)現(xiàn)，同時(shí)出現(xiàn)在本研究中的一些具有發(fā)酵能力的微生物在肇州縣粘豆包酸面團(tuán)中也并被發(fā)現(xiàn)，這進(jìn)一步說明了粘豆包酸面團(tuán)中微生物的多樣性具有一定的地域特色。

［1］孫大慶，李洪飛，楊健，等.東北粘豆包中一株羅伊氏乳桿菌的分離、鑒定與益生性質(zhì)研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2015（5）: 106-110

［2］劉少才.東北的老粘豆包［J］.中國(guó)保健食品，2014（12）:70-70

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［5］楊健，孫大慶.東北粘豆包發(fā)酵面團(tuán)中細(xì)菌多樣性研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2015（5）:78-81

［6］Chen T，Deng K，Xin L，et al.Effect of the Different Composition of Wheat，Rice，Buckwheat，Sweet Potato and Corn on Sourdough Characteristics and Sensory of Mantou［J］.J Nutr Food Sci，2015，5:336 doi:10.4172/2155-9600.1000366

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Microbial Diversity Analysis of Sticky Bean Bun Sourdough from Different Regions

TAO Dong-ya1，JIN Yin-qi2
（1.Mechanical and Electrical Engineering College，Taizhou Vocational and Technical College，Taizhou 318000，Zhejiang，China；2.Taizhou Guang-yue Drinking Water Equipment Co.，LTD.，Taizhou 318020，Zhejiang，China）

In this study，as the research objects，the sticky bean bun sourdough from different regions were collected，and analyzed using the denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）and gene sequencing technology to reveal the diversity of bacteria and fungi in these samples.The results showed that the diversity of bacteria was higher than that of fungi in all four samples.There were seven different bacteria strains，and four different fungi strains，among them，the Lactobacillus was The most abundant genus.By comparing the diversity of samples from different regions，it was found that there was a connection between microbial diversity of sticky bean bun and collection regions.

sticky bean bun sourdough；microbial diversity；denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）；gene sequencing

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.037

2014年浙江省生態(tài)省建設(shè)目標(biāo)責(zé)任制考核重大科技項(xiàng)目；臺(tái)州市科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（14GY07）；2014年度浙江省高校國(guó)內(nèi)訪問工程師校企合作項(xiàng)目（FG2014131）

陶東婭（1983—），女（漢），講師，碩士研究生，主要研究方向：純水機(jī)控制、食品機(jī)械。

2016-04-19