李平凡，王文文，趙鑫，李靜，姚勇芳，鄧毛程（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣東廣州510300）

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酒精飲料的總皂苷純化和定量方法研究

李平凡，王文文，趙鑫，李靜，姚勇芳，鄧毛程*
（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣東廣州510300）

采用固相萃取小柱提純酒精飲料樣品中的總皂苷，并采用內(nèi)標(biāo)法和比色法相結(jié)合的方法進(jìn)行定量檢測(cè)。提純方法具有操作步驟簡(jiǎn)單，且過程中損失量少的優(yōu)點(diǎn)；將其用于酒精飲料中總皂苷含量的檢測(cè)可提高該檢測(cè)方法的靈敏度和重復(fù)性，使該檢測(cè)方法的適用范圍更廣；本研究結(jié)果表明，酒精飲料樣品經(jīng)HC-C18、HLB固相萃取小柱的純化處理，總皂苷（以三七皂苷R1計(jì)）得率達(dá)到95%～96%。此外，該檢測(cè)方法使用內(nèi)標(biāo)，可將樣品純化過程的損失計(jì)算在內(nèi)，從而提高了檢測(cè)方法的精確度，精確度達(dá)到總皂苷RSD1.7%；穩(wěn)定性測(cè)定RSD達(dá)到1.46%；重復(fù)性測(cè)定RSD達(dá)到1.04%；平均回收率測(cè)定為93.85%，RSD為1.65%。

總皂苷；固相萃取小柱；純化；定量；酒精飲料

皂苷是一類由甾體或是三萜類化合物作為苷元與糖分子縮合而成的低聚糖苷，在自然界分布很廣，是很多中草藥中的主要活性成分。在保健食品、保健中藥和藥食兩用的食材中，總皂苷被認(rèn)為是以多味中藥為主原料的保健品中的主要功效成分，具有保護(hù)心血管、提高記憶力、抗疲勞、改善機(jī)體免疫力、抗菌等有價(jià)值的生物活性。因此對(duì)酒類食品基質(zhì)中總皂苷含量的質(zhì)量控制有重要意義。

關(guān)于總皂苷的純化和測(cè)定方法有很多研究報(bào)道。采用大孔吸附樹脂法，是目前提取分離純化總皂苷的普遍方法。徐媛等采用Amberlite XAD-2大孔樹脂純化保健酒樣品，以期去除一定的雜質(zhì)，提高酒類樣品中總皂苷的含量［1］。同樣江長(zhǎng)源等也使用XAD-2大孔樹脂對(duì)傳統(tǒng)保健酒中的總皂苷進(jìn)行純化［2］。利用傳統(tǒng)的溶劑萃取也是提純總皂苷的常用方法。任小虎等采用無水乙醇和正丁醇反復(fù)沉淀，對(duì)保健酒類樣品中的總皂苷進(jìn)行提取分離［3］；李兆明等采用正丁醇結(jié)合超聲波提取，反復(fù)沉淀提純保健酒中人參總皂苷，通過比色法測(cè)定含量［4］。傳統(tǒng)采用大孔樹脂純化樣品后，直接使用比色法測(cè)定總皂苷含量。不同的前處理方法對(duì)保健食品中總皂苷含量的測(cè)定有明顯的影響。本研究選用不同的大孔樹脂處理，結(jié)合比色法測(cè)定含量，對(duì)不同前處理對(duì)總皂苷的回收率進(jìn)行比較，得出D-101和D-941聯(lián)用對(duì)總皂苷的純化效果最好［5］。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

三七皂苷R1和人參皂苷Re（HPLC級(jí)，＞97%）：上海純優(yōu)生物科技有限公司；HC-C18固相萃取小柱、HLB固相萃取柱、聚酰胺（PA）小柱、GCB/NH2（碳黑/氨基）小柱、Si硅膠小柱：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸等：上海國(guó)藥集團(tuán)；去離子水（自制）；酒精飲料：市售（下稱飲料）。

SHIMADZU UV-2550紫外分光光度計(jì)、分析天平、Agilent 1260高效液相色譜儀、HWS12型水浴鍋：上海一恒科技有限公司。

1.2方法

1.2.1固相萃取柱子選擇

1.2.1.1固相萃取柱子預(yù)處理

固相萃取小柱HC-C18、HLB、聚酰胺PA、GCB/ NH2、Si硅膠小柱，先用2-3BV的甲醇活化，再用2-3BV的蒸餾水沖洗，備用。

1.2.1.2樣品純化

將稀釋好的樣品溶液2 mL（內(nèi)含100 μL的三七皂苷R1溶液），加入已預(yù)處理好的5種小柱，先用4 mL的蒸餾水沖洗，去除雜質(zhì)，再分別用2 mL的100%甲醇將皂苷洗脫，收集洗脫液。待HPLC檢測(cè)。

1.2.1.3高效液相色譜檢測(cè)

將1.2.1.2中得到的洗脫液，過0.45 μm的濾膜，待HPLC檢測(cè)。高效液相色譜檢測(cè)條件：流動(dòng)相分別為A相：純水，B相：乙腈，色譜純；梯度洗脫條件（體積比）：0 min～20 min：15%～40%B相；流速1 mL/min；C18色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）；柱溫：20℃～40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm。

加入內(nèi)標(biāo)三七皂苷R1的樣品溶液（已經(jīng)過柱子純化），在HPLC檢測(cè)下，得到內(nèi)標(biāo)的峰面積A1；同樣條件下，HPLC檢測(cè)同樣濃度的三七皂苷R1溶液，得到峰面積A2。按照峰面積比，計(jì)算內(nèi)標(biāo)得率。

1.2.2比色法測(cè)定總皂苷含量

精確吸取1.2.1.2制備的皂苷純化液200 μL于具塞試管中，在60℃水浴蒸干，加入0.2 mL，5%香草醛-冰乙酸溶液，混勻；再加入0.8 mL高氯酸，搖勻，在60℃水浴加熱15 min，取出后迅速冰浴冷卻5 min，加入5 mL冰乙酸稀釋，混勻，靜置2 min。以不加樣品溶液為空白，在400 nm～700 nm處掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。在最大吸收波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度值。

精確吸取200 μL的0、0.10、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL的人參皂苷溶液于具塞玻璃試管中，在60℃水浴揮干，按照比色法顯色后，在545 nm處測(cè)定吸光度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2　結(jié)果與討論

2.1固相萃取柱子純化效果比較分析

飲料加入三七皂苷R1內(nèi)標(biāo)后，經(jīng)過各種柱子的純化后，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，獲得三七皂苷R1的峰面積，并計(jì)算得率。經(jīng)過對(duì)飲料的HPLC檢測(cè)最后得到總皂苷得率，如圖1所示。

圖1　總皂苷得率（以三七皂苷R1計(jì)）Fig.1　The rate of total saponins（three seven saponins R1）

經(jīng)過HC-C18、HLB柱子純化，得率為95%～96%。經(jīng)GCB/NH2柱、PA聚酰胺柱、Si凝膠柱純化，三七皂苷R1得率分別為70%、60%、40%。因此HC-C18和HLB顯著優(yōu)于其他3種固相萃取小柱（P＜0.05）。最后確定HC-C18固相萃取小柱純化、制備飲料中的皂苷，內(nèi)標(biāo)得率為96%。

2.2總皂苷測(cè)定

精確吸取200 μL的系列人參皂苷Re溶液于具塞玻璃試管中，在60℃水浴揮干，按照1.2.2顯色后，在545 nm處測(cè)定吸光度值。以濃度和吸光度值擬合，得到人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，見圖2。

圖2　人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Ginseng saponin standard curve

得出回歸方程為：y=0.608x-0.003 2，R2=0.999 4。說明皂苷含量在0～1.4 mg/mL范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好。按照上述方法，測(cè)定市售飲料中總皂苷的含量為（0.22±0.02）mg/mL。

2.3方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1精密度

同一樣品溶液6份（按照1.2.1.2處理），依1.2.2顯色后，連續(xù)測(cè)定吸光度值，結(jié)果見表1。

表1　精密度試驗(yàn)吸光度值Table 1　Absorbance value of precision test

總皂苷RSD值為1.70%（n=6），表明精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性

精密吸取樣品溶液200 μL，依1.2.2顯色后放置，每隔10 min測(cè)定一次吸光度值，結(jié)果見表2。

表2　穩(wěn)定性試驗(yàn)吸光度值Table 2　Stability test absorbance value

RSD（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）為1.46%，表明在70 min內(nèi)較穩(wěn)定。

2.3.3重復(fù)性

樣品溶液6份，按照1.2.1.2處理，依1.2.2顯色后，測(cè)定吸光度值，結(jié)果見表3。

表3　重復(fù)性試驗(yàn)吸光度值Table 3　Repeatability test absorbance value

RSD為1.07%，表明重復(fù)性較好。

2.3.4回收率

精確量取不同量的人參皂苷Re對(duì)照品，加入已知含量的樣品中，顯色后，測(cè)定吸光度值，并計(jì)算其回收率。結(jié)果見表4。

表4　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4　Experiment results of sample recovery

平均回收率為93.85%，RSD為1.65%，試驗(yàn)表明本法回收率較高，方法可行。

3　結(jié)論

本研究結(jié)果表明，飲料樣品經(jīng)HC-C18、HLB固相萃取小柱的純化處理，總皂苷（以三七皂苷R1計(jì)）得率較好。本試驗(yàn)的HLB結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道［6］相似，茅向軍等采用不同填料（Waters Oasis HLB柱，ODS小柱，Strata小柱）的固相萃取小柱，對(duì)血漿中人參皂苷Re進(jìn)行純化處理，結(jié)果表明HLB柱有較好的處理效果。本研究最終選擇了C18（HC-C18）固相萃取小柱，作為飲料中總皂苷的提純方法，采用內(nèi)標(biāo)法和比色法相結(jié)合的方法進(jìn)行檢測(cè)，具有操作步驟簡(jiǎn)單，且過程中損失量少的優(yōu)點(diǎn)。從方法學(xué)方面，驗(yàn)證了本方法對(duì)于飲料總皂苷含量檢測(cè)具有重現(xiàn)性好、精密度高、穩(wěn)定性好和回收率高等優(yōu)點(diǎn)。

［1］徐媛，白少偉，龐文生，等.保健酒中總皂苷含量測(cè)定方法研究［J］.藥物研究，2014（6）:30-31

［2］江長(zhǎng)源，王勤，黃瑋嵐，等.傳統(tǒng)保健酒中功效成分的檢測(cè)和穩(wěn)定性研究［J］.釀酒科技，2008（3）:78-80

［3］任小虎，饒鋮樂，史路路，等.保健酒中人參皂苷含量的測(cè)定［J］.釀酒，2012，39（3）:65-67

［4］李兆明，姬濤，侯林，等.比色法測(cè)定保健酒中人參總皂苷含量［J］.吉林中醫(yī)藥，2009，29（5）:425-426

［5］彭維，李雙祁，歐愛芬，等.不同前處理方法對(duì)保健食品中總皂苷含量測(cè)定的影響［J］.食品研究與開發(fā)，2014（8）:90-93

［6］茅向軍，章晨峰，孫棣，等.不同填料的固相小柱對(duì)人參皂苷Re血漿樣品萃取回收率的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2005，30（19）:1516-1518

Study on the Quantitative and Purification Method of Total Saponins in Alcoholic Beverage

LI Ping-fan，WANG Wen-wen，ZHAO Xin，LI Jing，YAO Yong-fang，DENG Mao-cheng*
（Department of Food and Biological Engineering，Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，Guangdong，China）

Purification of total saponins in beverage samples by solid phase exctraction column，and the internal standard method and colorimetric method of combining the quantitative detection.The purification method had the advantages of simple operation steps，and less loss in the process.The content of total saponins in beverages for detection can improve the sensitivity of the detection methodand the repeatability，the scope of application of the method to detect a wider.This study results showed that the samples of alcoholic beverages by HC-C18，HLB solid-phase extraction column purification processing，total saponins（notoginseng saponin R1）yield of 95%-96%.In addition，the detection method using internal standard，could be calculated and purification process of sample loss，so as to improve the detection accuracy.Accuracy total saponins RSD 1.7%；determination of stability of RSD of 1.46%；determination of repeatability RSD of 1.04%.The average recovery was 93.85%，RSD was 1.65%.

total saponin；solid phase extraction；purification；quantification；alcoholic beverage

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.027

創(chuàng)新強(qiáng)校工程專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2Q10905）；創(chuàng)新強(qiáng)校工程專項(xiàng)資金項(xiàng)目（1A20201）；創(chuàng)新強(qiáng)校工程專項(xiàng)資金項(xiàng)目（1A10205）；廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心建設(shè)項(xiàng)目（GCZX-B1103）；創(chuàng)新強(qiáng)校工程專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2A20301）；創(chuàng)新強(qiáng)校工程專項(xiàng)資金項(xiàng)目（1A20105）

李平凡（1973—），男（漢），教授，碩士，從事食品生物技術(shù)教學(xué)與科研。

鄧毛程（1971—），男（漢），教授，博士，從事食品生物技術(shù)教學(xué)與科研。

2015-06-24