韋舒靜　董利軍　魯曉嵐　曹　璋

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·論著·

艱難梭菌在腸易激綜合征和炎癥性腸病患者中的感染情況及與白細(xì)胞介素-8基因-251 A/T多態(tài)性的關(guān)系研究

韋舒靜董利軍魯曉嵐曹璋

目的探討艱難梭菌(C.difficile)在腸易激綜合征(IBS)和炎癥性腸病(IBD)患者中的感染情況及與白細(xì)胞介素8(IL-8)基因-251 A/T多態(tài)性的關(guān)系。方法研究選取經(jīng)澄城縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科及肛腸科診斷為IBS、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、克羅恩病(CD)的患者(分別為76 例、90 例、83 例)，同時選取90位健康志愿者作為對照組，比較C.difficile在各組中的感染情況，探討C.difficile感染與基因位點(diǎn)多態(tài)性的關(guān)系。結(jié)果UC 組、CD 組的感染率顯著高于IBS 組和對照組(P<0.05)，而IBS 組與對照組的C.difficile感染率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，UC 組與CD組的感染率差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。UC組血液中IL-8的濃度高于CD 組、IBS 組及對照組，而CD 組的濃度高于IBS 組和對照組，IBS 組及對照組血液中IL-8濃度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論C.difficile感染可使患者血液中IL-8濃度升高，IL-8基因-251 A/T多態(tài)性AA基因型是C.difficile感染的危險因素。

艱難梭菌；腸易激綜合征；炎癥性腸病；感染率；白細(xì)胞介素8；多態(tài)性

近年來，由于抗生素在中國使用較頻繁且廣泛，艱難梭菌(C.difficile)相關(guān)性疾病的發(fā)病率也呈逐年升高趨勢，并出現(xiàn)了新的毒力更強(qiáng)的菌株[1-3]。目前尚缺乏強(qiáng)有力的研究數(shù)據(jù)以準(zhǔn)確、有效地評估在中國的不同人群中C.difficile的感染情況及危險因素，因此尚不能準(zhǔn)確、全面地預(yù)防和治療C.difficile相關(guān)性疾病[4-6]。本研究探討了C.difficile在腸易激綜合征(IBS)患者、炎癥性腸病(IBD)患者及健康人群中的感染情況，并調(diào)查其感染的危險因素，為IBS、IBD的早期診斷及預(yù)防提供了科學(xué)依據(jù)，對于進(jìn)一步控制C.difficile感染相關(guān)性疾病的發(fā)病率和病死率具有重要的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義。

1　材料及方法

1.1材料

收集2011年10月至2013年2月在澄城縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科及肛腸科被診斷為IBS 及潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、克羅恩病(CD)患者的糞便及血液標(biāo)本，其中最終納入研究的IBS 患者共有76 例，UC 患者共90 例，CD 患者共83例，同時收集90位健康志愿者的糞便及血液標(biāo)本。C.difficile標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國微生物菌種保藏中心。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本的采集及儲存收集所有入選的人群未使用任何藥物前的第1次排便的糞便，用無菌便盒收集新鮮的糞便>500 mg(或水樣便>500 μL)，并于30 min內(nèi)置于-80℃冰箱凍存，待測；收集入選人群血液2 mL，置-80℃冰箱凍存，待測。盡量避免反復(fù)凍融。

1.2.2糞便基因組DNA的提取步驟按照糞便基因組DNA 提取試劑盒說明書操作。

1.2.3C.difficile標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)培養(yǎng)基配方：蛋白胨15 g、酵母粉5 g、大豆胨5 g、牛肉粉5 g、葡萄糖5 g、氯化鈉5 g、可溶性淀粉3 g、半胱氨酸0.5 g、磷酸二氫鉀2.5 g、氯化血紅素0.005 g、維生素K1 0.001 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。復(fù)蘇培養(yǎng)：用無菌吸管吸取約0.5 mL的液體培養(yǎng)基于安瓿管中使干燥菌種全部溶解，溶解后吸出并放入盛有4～5 mL液體培養(yǎng)基的試管中，置于36℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.4聚合酶鏈法檢測C.difficile毒素設(shè)計(jì)針對C.difficile毒素B保守區(qū)的引物，以提取的糞便基因組DNA 為模板，其中陽性對照及陰性對照的模板分別以C.difficile標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA 及超純水代替，按照試劑盒要求進(jìn)行操作。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附法檢測C.difficile毒素按照試劑盒要求進(jìn)行操作，有效性判斷：陽性對照孔(B孔)平均值≥1.00，陰性對照孔(A孔)平均值≤0.10。臨界值=陰性對照孔平均值+0.15。陰性判定：樣品光密度(OD)值<臨界值者為C.difficile毒素陰性；陽性判定：樣品OD值≥臨界值者為C.difficile毒素陽性。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附法檢測血液中白細(xì)胞介素-8的濃度按照試劑盒要求進(jìn)行操作，以白細(xì)胞介素-8(IL-8)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD 值，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，然后根據(jù)樣品的OD值，計(jì)算出樣品的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

1.2.7Sanger方法檢測IL-8基因-251 A/T 多態(tài)性以單條DNA 鏈為模板，合成其互補(bǔ)鏈，在合成原料(2′脫氧核苷酸)中摻入已用不同顏色熒光標(biāo)記過的2′3′雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行延伸反應(yīng)，而合成互補(bǔ)鏈的反應(yīng)會隨機(jī)終止，從而能夠在終止處得到大量的帶有標(biāo)志物的DNA 片段，這些DNA片段長度不一，但僅相差1個bp，通過高分辨率的電泳分離，根據(jù)標(biāo)志物的不同熒光顏色可測出堿基的序列，從而得到DNA 的序列。將擴(kuò)增成功的樣品送測序公司測序。用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對，同時打開峰圖查看待檢測位點(diǎn)的熒光信號。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1基本資料

在所有的入選對象中，IBS 組共76例，其中男性37 例，女性39 例，平均年齡(32.72±4.06)歲；UC 組共90例，其中男性48例，女性42例，平均年齡(36.28±3.04)歲；CD組共83例，其中男性39例，女性44例，平均年齡(35.71±5.98)歲，正常對照組共90例，男、女各45例，平均年齡(34.56±4.37)歲。以疾病的嚴(yán)重程度區(qū)分，UC組病情為輕型的有17 例、中型41例、重型32例，而CD組輕、中、重型分別有43例、32例、8例，因此，UC 組的病情較CD 組更嚴(yán)重，可能會對本研究結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。在UC患者和CD患者中，近期使用過質(zhì)子泵抑制劑(PPI)的分別有39例、36 例，長期使用激素灌腸治療的分別有20 例、18 例，近期使用全身性糖皮質(zhì)激素的分別有36 例、35 例，近期使用免疫抑制劑的分別有29 例、31 例，兩組中聯(lián)合使用激素及免疫抑制劑的均為8 例。UC 組中為初發(fā)患者的有18 例，CD 組有21 例；UC 組中疾病處于復(fù)發(fā)活動期的有51 例，CD 組有40 例。

2.2C.difficile的感染情況

各組患者的C.difficile感染率不同，由高到低依次為UC 組、CD 組、IBS 組、正常組。UC 組、CD 組的感染率顯著高于IBS 組和對照組(P<0.05)，而IBS 組與對照組的C.difficile感染率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，UC 組與CD組的感染率差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖1。

表1　各組C.difficile感染情況比較

注：與正常組相比較，aP<0.05；與IBS組相比較，bP<0.05

注：圖1A、圖1B均左起依次編號，第1孔為MarkerⅠ，第2孔為陽性對照，第3孔為陰性對照，第4至第8孔為標(biāo)本；MarkerⅠ最亮條帶處為400 bp。圖1A：陽性對照產(chǎn)物為173 bp，陰性對照無條帶出現(xiàn)，該組標(biāo)本均無條帶出現(xiàn)，該組標(biāo)本均未感染C.difficile；圖1B：陽性對照產(chǎn)物為173 bp，陰性對照無條帶出現(xiàn)，標(biāo)本孔第4、5、6、7 孔均未出現(xiàn)條帶，為未感染C.difficile標(biāo)本，第8 孔出現(xiàn)目的條帶，為C.difficile感染陽性。

圖1PCR 擴(kuò)增檢測C.difficile毒素B 電泳圖

2.3血液中IL-8 濃度的比較

UC組血液中IL-8 濃度相較于CD 組、IBS 組和對照組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.944，P<0.01)，UC 組和CD 組濃度較IBS組和對照組高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。這可能與不同疾病有關(guān)，若IBD患者的腸道黏膜炎性反應(yīng)較嚴(yán)重，則受損更加嚴(yán)重，細(xì)胞連接被破壞，產(chǎn)生更多的IL-8。

表2　各組血液中IL-8濃度比較/ng·L-1

注：與正常組相比較，aP<0.01；與IBS組相比較，bP<0.01。Q1、Q3 分別是25%、75%百分位數(shù)。

UC 組患者中，C.difficile感染陽性患者血液中IL-8濃度高于未感染者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.79，P<0.01)。CD 組患者中，C.difficile感染陽性患者血液中IL-8濃度高于未感染者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.73，P<0.01)。見表3。

表3　UC 組、CD 組中陽性、陰性之間IL-8 濃度的比較

注：與陰性組相比較，aP<0.01

2.4C.difficile陽性、陰性者之間IL-8 基因-251 A/T 多態(tài)性研究

研究在所有C.difficile陽性者與陰性者之間進(jìn)行比較，在31例陽性感染者中，AA、AT、TT 基因型所占比例依次為64.5%(20/31)、19.4%(6/31)、16.1%(5/31)；由此可知，C.difficile陽性感染者中血液IL-8基因-251位點(diǎn)多態(tài)性最多的基因?yàn)锳A 型，其次為AT 型。研究結(jié)果提示，人血液中IL-8 基因-251 位點(diǎn)AA 基因型是C.difficile感染的一個危險因素。見表4。

表4　各組中C.difficile陽性、陰性者

注：與陰性組相比較，aP<0.05

3　討論

C.difficile感染的相對危險因素包括使用廣譜抗生素、伴有嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病、使用PPI、處于免疫抑制狀態(tài)、使用激素、老齡、近期有手術(shù)史以及出現(xiàn)毒力更強(qiáng)的新型產(chǎn)毒菌株等[1]。近年來的研究將一些暴露于腸道病原體和胃腸道感染后引起的IBS與“感染后IBS”的概念相結(jié)合。腸道微生物的改變和黏膜免疫反應(yīng)已用于闡述IBS的發(fā)病機(jī)制，這種變化導(dǎo)致宿主和腸腔菌群之間關(guān)系紊亂，而這些可由腸胃炎進(jìn)展而來，即一部分IBS可由腸胃炎治愈后進(jìn)展而來[2-4]。C.difficile感染可導(dǎo)致腸道炎性反應(yīng)，增加了腸道黏膜的通透性，使中性粒細(xì)胞聚集，破壞細(xì)胞之間的連接。而宿主體中缺少IgG抗體反應(yīng)是初發(fā)和復(fù)發(fā)性C.difficile感染的一個重要的免疫學(xué)因素[5]。本文對C.difficile在IBS患者中的感染情況進(jìn)行研究，旨在探討在IBS患者中是否會有更高的C.difficile感染率，以及IBS是否可作為C.difficile感染的一個危險因素。通過研究發(fā)現(xiàn)，雖然從研究結(jié)果可知IBS患者的感染率約是正常人群的兩倍，但兩者之間的差異卻無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這可能是由于本研究受到樣本量較小的限制。Clayton等[6]的研究納入了沒有相關(guān)危險因素的87例IBS患者，檢測出有5例感染C.difficile(5.7%)，其中有4例是產(chǎn)毒菌株(4.6%)，而在88例正常對照組中檢出1例C.difficile感染陽性(1.1%)。

IBD包括UC和CD，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。IBD患者經(jīng)常因腹痛、腹瀉而住院，但其始發(fā)因素可能是基礎(chǔ)性疾病或者是感染了腸道的微生物或條件致病菌(如C.difficile)。在IBD患者中發(fā)現(xiàn)有越來越多的C.difficile感染者，C.difficile感染對于IBD患者的影響至今尚不清楚，但I(xiàn)BD患者具備很多C.difficile感染的危險因素，因此可以推測，IBD患者更容易感染C.difficile。因?yàn)榇蠖鄶?shù)IBD患者的復(fù)發(fā)常常不能與C.difficile感染相區(qū)分，所以使部分研究較少意識到在IBD患者中C.difficile的感染情況。有研究報道在IBD的發(fā)病中，C.difficile感染占了5%～19%[7]。本研究中UC患者的C.difficile感染率并不高，這可能與樣本量較小、檢測方法不同以及納入的研究對象的病情輕重程度有關(guān)。

IL-8是一種炎性因子，在中性粒細(xì)胞趨化以及炎性反應(yīng)過程中起著重要作用，但I(xiàn)L-8基因的多態(tài)性與C.difficile感染之間的關(guān)系尚不清楚。有研究表明，IL-8基因啟動區(qū)-251位點(diǎn)與人糞便中IL-8濃度增高有關(guān)[8]，而這可能與在入選研究對象時，UC組患者的病情程度較CD組嚴(yán)重有關(guān)。炎性反應(yīng)嚴(yán)重時，必然會導(dǎo)致細(xì)胞連接破壞加重，將有更多的中性粒細(xì)胞聚集，IL-8濃度也將隨之增高。本研究納入的研究對象中UC組患者的病情較CD組嚴(yán)重，對血液中IL-8濃度也會產(chǎn)生一定的影響。

此外，本文對各組中C.difficile陽性和陰性者的血液IL-8基因-251位點(diǎn)多態(tài)性的差異進(jìn)行了研究。結(jié)果指出，各組中除了對照組由于陽性例數(shù)過少，其他3組的陽性感染者中AA基因型所占比例較大，提示IL-8基因-251 A/T多態(tài)性AA基因型更容易發(fā)生C.difficile感染。

C.difficile感染相關(guān)性疾病的發(fā)病率越來越高，其危害性及所帶來的醫(yī)療負(fù)擔(dān)也越來越嚴(yán)重，及時、準(zhǔn)確地了解C.difficile的感染情況及危險因素，能夠?yàn)镃.difficile感染的預(yù)防、治療提供更好的幫助，對減少其發(fā)病率、提高治愈率有著重要意義。綜上所述，C.difficile在IBD患者中有較高的感染率；C.difficile感染所引發(fā)的炎性反應(yīng)可增加各組陽性患者血液中IL-8的濃度；IL-8基因-251 A/T的多態(tài)性與C.difficile感染有關(guān)，該位點(diǎn)為AA基因型者更容易感染C.difficile，即IL-8基因-251 AA基因型是C.difficile感染的一個危險因素。

1 郭桂萍, 董創(chuàng)創(chuàng), 戴潔, 等. 艱難梭菌毒素A C端結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)與卵黃抗體的制備[J].軍事醫(yī)學(xué), 2013, 37: 676-680.

2 Parkes GC, Brostoff J, Whelan K, et al. Gastrointestinal microbiota in irritable bowel syndrome: their role in its pathogenesis and treatment[J]. Am J Gastroenterol, 2008, 103: 1557-1567.

3 Quigley EM. Bacterial flora in irritable bowel syndrome: role in pathophysiology, implications for management[J]. J Dig Dis, 2007, 8: 2-7.

4 Spiller RC. Role of infection in irritable bowel syndrome[J]. J Gastroenterol, 2007, 42: 41-47.

5 Kyne L, Warny M, Qamar A, et al. Asymptomatic carriage ofClostridiumdifficileand serum levels of IgG antibody against toxin A[J]. N Engl J Med, 2000, 342: 390-397.

6 Clayton EM, Rea MC, Shanahan F, et al. Carriage ofClostridiumdifficilein outpatients with irritable bowel syndrome[J]. J Med Microbiol, 2012, 61: 1290-1294.

7 鐘嵐, 徐文, 王煒, 等. 羅馬Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)診斷的腸易激綜合征患者中無致病性難辨梭狀芽孢桿菌感染[J]. 胃腸病學(xué), 2010, 15: 160-162.

8 Mylonaki M, Langmead L, Pantes A, et al. Enteric infection in relapse of inflammatory bowel disease: importance of microbiological examination of stool[J]. Eur J Gastroenterol Hepatol, 2004, 16: 775-778.

(本文編輯：周駿)

Clostridium difficile in patients with IBS, IBD infection situation and with IL-8 gene-251 A/T loci polymorphismWEIShujing.DepartmentofGastroenterology,People′sHospitalofChengchengCounty,Weinan(715200),China;DONGLijun.DepartmentofPharmacy,People′sHospitalofChengchengCounty,Weinan(715200),China;LUXiaolan.DepartmentofGastroenterology,TheSecondAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an(710065),China;CAOZhang.DepartmentofPathologyTeachingandResearchSection,BinzhouMedicalCollege,Binzhou(256603),Shandong,China

ObjectiveAn attempt was made in this paper to investigate the clostridium difficile (C.difficile) bacteria in patients with irritable bowel syndrome (IBS), inflammatory bowel disease(IBD) infection situation and with IL-8 gene-251 A/T loci polymorphism. MethodsSeventy-six cases of IBS, ninety cases of ulcerative colitis(UC), eighty-three cases of Crohn′s disease(CD), and ninety cases of normal population were selected and the C. difficile infection in each group was compared to find out the relationship between C. difficile infection and polymorphic loci. ResultsThe infection rate of the UC group and CD group were higher than that of the IBS group and the normal group (P<0.05). There is no significant difference in C. difficile infection rate between the UC group and the CD group (P>0.05). The IL-8 in the UC group was higher than that in the CD group, the IBS group, and the normal group. There is no significant difference in IL-8 between the IBS group and the normal group (P>0.05). ConclusionC. difficile infection can increase the IL-8 and IL-8 gene -251 A/T is the risk factor for C. difficile infection.

Clostridium difficile; Irritable bowel syndrome; Inflammatory bowel disease; Infection rate; IL-8; Polymorphism

山東省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(ZR2011HQ025)

715200陜西省渭南市澄城縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科(韋舒靜)；715200陜西省渭南市澄城縣人民醫(yī)院藥劑科(董利軍)；710065陜西省西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(魯曉嵐)；256603山東省濱州市濱州醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室(曹璋)

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.02.013

2015-06-10)