魏國(guó)微，李克躍

（貴州省人民醫(yī)院 1.干部綜合病房，2.肝膽外科，貴州 貴陽(yáng) 550002）

論著

川芎嗪對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1/S m a d s通路的影響

魏國(guó)微1，李克躍2

（貴州省人民醫(yī)院 1.干部綜合病房，2.肝膽外科，貴州 貴陽(yáng) 550002）

目的通過(guò)研究川芎嗪對(duì)體外培養(yǎng)的血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞（H S C）轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（T G F-β1）/S m a d s通路的作用，探討其治療肝纖維化的機(jī)制。方法對(duì)大鼠H S C使用血管緊張素Ⅱ（1×10-5m ol/L）及血管緊張素Ⅱ（1×10-5m ol/L）聯(lián)合不同濃度的川芎嗪（0.04、0.20和1.00m g/m l）干預(yù)48 h，活細(xì)胞計(jì)數(shù)法（CC K-8）檢測(cè)各組細(xì)胞增殖水平的變化，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)及W e s t e r n blot檢測(cè)各組細(xì)胞T G F-β1、S m a d2、S m a d4的mR NA及蛋白表達(dá)。結(jié)果血管緊張素Ⅱ明顯促進(jìn)H S C的增殖，同時(shí)上調(diào)該細(xì)胞T G F-β1、S m a d2、S m a d4的mR NA及蛋白表達(dá)（P＜0.01），而血管緊張素Ⅱ?qū) S C的誘導(dǎo)作用可被川芎嗪抑制（P＜0.01），并呈現(xiàn)濃度依耐性。結(jié)論川芎嗪抗肝纖維化的機(jī)制之一可能是通過(guò)調(diào)控肝星狀細(xì)胞T G F-β1/ S m a d s通路實(shí)現(xiàn)的。

肝星狀細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1/S m a d s；川芎嗪；血管緊張素Ⅱ

肝纖維化是指肝臟內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)（特別是膠原物質(zhì)）過(guò)度沉積，是機(jī)體對(duì)各種病因引起的慢性肝損傷后的一種損傷修復(fù)反應(yīng)［1］，是肝硬化的早期可逆階段，如不及時(shí)治療則可能進(jìn)展成為失代償期肝硬化并出現(xiàn)各種終末期肝病等并發(fā)癥［2］。我國(guó)是肝硬化的高發(fā)地區(qū)，因此，肝纖維化的深入研究對(duì)緩解肝纖維化病情具有重要的臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，H S C）在肝纖維化發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用［3-5］。血管緊張素Ⅱ通過(guò)促進(jìn)H S C發(fā)生，影響轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（trans f ormin g g ro w th f actor-β1，T G F-β1），參與肝纖維化形成［6-8］。T G F-β1/S mads通路在H S C激活、增殖及肝纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用［5，9］。報(bào)道顯示，活血化瘀中藥川芎嗪具有一定的抗組織纖維化作用［10-15］，但其未徹底闡明抗肝纖維化的機(jī)制，對(duì)血管緊張素Ⅱ干預(yù)后H S C的T G F-β1/S mads通路作用也不清楚。為探索川芎嗪對(duì)血管緊張素Ⅱ干預(yù)后H S C的T G F-β1/S mads通路的作用，筆者使用血管緊張素Ⅱ及血管緊張素Ⅱ聯(lián)合不同濃度的川芎嗪對(duì)大鼠H S C細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，并檢測(cè)細(xì)胞增殖水平及細(xì)胞T G F-β1、S mad2、S mad4 的m R N A及蛋白表達(dá)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑、儀器

大鼠肝星狀細(xì)胞H S C-T6購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（d u lbecco's minim u m essential medi u m，D M E M）（高糖型，美國(guó)H yclone公司），0.25%胰酶（美國(guó)H yclone公司），胎牛血清（美國(guó)H yclone公司），S YB RR P remi x E x Ta qTM實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（q R T-PC R）試劑盒（日本Ta K a R a公司），T G F-β1、S mad2、S mad4及β肌動(dòng)蛋白引物（美國(guó)I ntro g en公司），T G F-β1正向引物：T GG CG TT A CC TT GG T AA CC，反向引物：GG T G TT G A GCC C TTT CC A G；S mad2正向引物：CC A GG T C T C TT G A T G G T CG T，反向引物：GGCGGC A G TT C T G TT A G AA T；S mad4正向引物：C TTTT GC TT GGG T C AA C T C T C，反向引物：T GGGC T C A CGC A T A T A TTT CC；β肌動(dòng)蛋白正向引物：A GGCC A T G T A CG T A GCC A T CC A，反向引物序列：T C T CCGG A G T CC A T C A C AA T G。抗T G F-β1抗體及抗S mad4抗體（英國(guó)A bcam公司），抗β肌動(dòng)蛋白抗體（北京全式金生物技術(shù)有限公司），活細(xì)胞計(jì)數(shù)法（cell co u ntin g k it-8，CC K-8）試劑盒（上海生工生物技術(shù)有限公司），血管緊張素Ⅱ（美國(guó)S i g ma公司），注射用鹽酸川芎嗪（北京四環(huán)科寶有限公司）。

1.2細(xì)胞的培養(yǎng)

大鼠肝星狀細(xì)胞H S C-T6，調(diào)整細(xì)胞密度為4× 104～5×104個(gè)/ml，置于37℃、5%二氧化碳C O2培養(yǎng)箱內(nèi)用含10%胎牛血清的D M E M培養(yǎng)。每3天換培養(yǎng)液1次。5～7 d細(xì)胞布滿瓶底后使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取4～6代H S C進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞的分組及其處理

將培養(yǎng)好的4～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。總共分為5個(gè)組，即對(duì)照組、血管緊張素Ⅱ1×10-5mol/L組（血管緊張素Ⅱ組）、血管緊張素Ⅱ（1×10-5mol/L）+川芎嗪0.04m g/ml組（血管緊張素Ⅱ+川芎嗪0.04組），血管緊張素Ⅱ（1×10-5mol/L）+川芎嗪0.20m g/ ml組（血管緊張素Ⅱ+川芎嗪0.20組），血管緊張素Ⅱ（1×10-5mol/L）+川芎嗪1.00m g/ml組（血管緊張素Ⅱ+川芎嗪1.00組）。待細(xì)胞長(zhǎng)到50%左右后，各組細(xì)胞置入無(wú)血清的D M E M培養(yǎng)饑餓過(guò)夜，次日各組細(xì)胞加入上述含不同濃度的川芎嗪培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

1.4觀察指標(biāo)及測(cè)定方法

1.4.1CC K-8法測(cè)定細(xì)胞增殖水平將成纖維細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/孔，每孔體積為100μl，每孔做5個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞在37℃、5%C O2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，加入不含或含有不同濃度的川芎嗪分別培養(yǎng)48 h，每孔加入10μl CC K-8試劑培養(yǎng)2.5 h，按細(xì)胞計(jì)數(shù)說(shuō)明書(shū)在酶標(biāo)儀上450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度值，采用目前普遍使用的扣除本底策略來(lái)消除誤差。

1.4.2q R T-P C R檢測(cè)T G F-β1、S m a d2及S m a d4 mR NA的表達(dá)各組細(xì)胞提取R N A，將純度好、完整性高的R N A合成cDN A。按2×S YB RR P remi x 10μl，正向引物0.4μl，反向引物0.4μl，cDN A 2μl，dd H2O 7.2μl配成總量20μl體系進(jìn)行q R T-PC R。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。目的基因的表達(dá)使用相對(duì)定量法，以β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參計(jì)算△C t，以2-△△ct計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3W e s t e r n blot法檢測(cè)T G F-β1及S m a d4的蛋白表達(dá)提取各組細(xì)胞總蛋白，采用二喹啉甲酸法定量蛋白濃度，所得蛋白于聚丙烯酰胺凝膠中電泳，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜后以足量的封閉液封閉，用一抗稀釋液按1∶5 000比例稀釋檢測(cè)蛋白的一抗，4℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜。去掉一抗孵育液后以足量三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（tris b uff ered saline and t w een 20，T B S T）搖床洗滌3次，每次10min，用二抗稀釋液按1∶5 000比例稀釋辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗后室溫振蕩孵育2 h，倒掉二抗孵育液后以足量T B S T洗滌3次，每次10 min，以電化學(xué)發(fā)光，顯影和定影方法對(duì)膠片進(jìn)行拍照和掃描，以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照，Q u antity one系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的相對(duì)灰度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用S P SS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組的比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1血管緊張素Ⅱ?qū) SC-T6增殖水平的影響

血管緊張素Ⅱ干預(yù)后的H S C增殖水平較正常值上升（t=-18.703，P=0.000），使用不同濃度的川芎嗪干預(yù)后，血管緊張素Ⅱ?qū) S C增殖的刺激作用受到抑制（川芎嗪濃度為0.04m g/ml時(shí)，t=5.630，P=0.000；川芎嗪濃度為0.20m g/ml時(shí)，t=8.628，P=0.000；川芎嗪濃度為1.00m g/ml時(shí)，t=17.508，P=0.000），且呈現(xiàn)濃度依耐性。見(jiàn)圖1及表1。

2.2血管緊張素Ⅱ及 TMP對(duì) H SC-T6細(xì)胞T GF-β1、S m a d2、S m a d4 m RN A表達(dá)的影響

使用血管緊張素Ⅱ（1×10-5mol/L）干預(yù)后，H S CT6的T G F-β1、S mad2、S mad4 m R N A表達(dá)均上調(diào)（T G F-β1：t=-58.751，P=0.000；S mad2：t=-36.644，P=0.000；S mad4：t=-80.719，P=0.000），但血管緊張素Ⅱ?qū) S C的調(diào)控作用被川芎嗪不同程度地抑制：①川芎嗪濃度為0.04m g/ml時(shí)，T G F-β1：t=1.905，P=0.105；S mad2：t=1.180，P=0.283；S mad4：t=2.417，P=0.052。②川芎嗪濃度為0.20m g/ml時(shí)，T G F-β1：t= 10.870，P=0.000；S mad2：t=9.092，P=0.000；S mad4：t=22.739，P=0.000。③T MP濃度為1.0m g/ml時(shí)，T G F-β1：t=15.187，P=0.000；S mad2：t=14.011，P= 0.000；S mad4：t=27.299，P=0.000。表現(xiàn)為濃度依耐性。見(jiàn)圖2及表2。

2.3血管緊張素Ⅱ及TMP對(duì)T GF-β1、S m a d4蛋白表達(dá)的影響

圖1　各組細(xì)胞增殖水平 （n=5，x±s）

表1　各組細(xì)胞增殖水平方差分析

圖2　各組細(xì)胞各基因m RN A相對(duì)表達(dá)量 （n=3，x±s）

表2　各組細(xì)胞各基因m RN A相對(duì)表達(dá)量方差分析

使用血管緊張素Ⅱ（1×10-5mol/L）干預(yù)后，H S C-T6的 T G F-β1及 S mad4蛋白表達(dá)均上調(diào)（T G F-β1：t=-49.025，P=0.000；S mad4：t=-32.745， P=0.000），但血管緊張素Ⅱ?qū) S C的調(diào)控作用被川芎嗪不同程度地抑制：①川芎嗪濃度為0.04m g/ml時(shí)，T G F-β1：t=2.380，P=0.055；S mad4：t=2.130，P= 0.077。②川芎嗪濃度為0.20m g/ml時(shí)，T G F-β1：t= 12.983，P=0.000；S mad4：t=11.202，P=0.000。③川芎嗪濃度為1.00m g/ml時(shí)，T G F-β1：t=17.259，P=0.000；S mad4：t=16.362，P=0.000。表現(xiàn)為濃度依耐性，與各基因m R N A的變化趨勢(shì)一致。見(jiàn)圖3、4和表3。

圖3　各組細(xì)胞各蛋白相對(duì)表達(dá)量 （n=3，x±s）

表3　各組細(xì)胞各蛋白相對(duì)表達(dá)量的方差分析

3　討論

肝纖維化是各種慢性肝病共有的病理改變，其特點(diǎn)是以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)過(guò)度沉積。肝星形細(xì)胞又稱I to細(xì)胞、維生素A儲(chǔ)存細(xì)胞、竇周細(xì)胞等，其約占肝內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的5%～8%，正常情況下具有貯存脂肪和維生素A、維持肝竇細(xì)胞外基質(zhì)平衡、肝竇膠原及微生態(tài)平衡等功能［16］。當(dāng)肝臟受到物理、化學(xué)及生物因素刺激時(shí)，通常靜止的H S C被“激活”或“活化”。而活化的H S C是肝纖維化時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源細(xì)胞，與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，在肝纖維化中起關(guān)鍵作用［5，9，17］。

T G F-β1作為一種細(xì)胞因子，在活化的H S C中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，T G F-β1反過(guò)來(lái)又能激活H S C，使其增殖旺盛。如果作用過(guò)度或持續(xù)表達(dá)，將會(huì)導(dǎo)致肝纖維化形成，是目前已知的與肝纖維化形成最密切的細(xì)胞因子［2，5，9］。一般情況下，T G F-β1是通過(guò)與其相應(yīng)受體TβRⅠ、TβRⅡ、內(nèi)皮蛋白結(jié)合形成復(fù)合物后調(diào)控S mad2/S mad3、S mad4、S mad6/S mad7等蛋白形成T G F-β1/S mads信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用［18］。在肝纖維化過(guò)程中，H S C中的 T G F-β1、S mad2、S mad4等的表達(dá)均明顯增強(qiáng)［19-20］，干預(yù)H S C中T G F-β1/S mads信號(hào)傳導(dǎo)通路中的T G F-β1、S mad2、S mad4等的表達(dá)已經(jīng)成為治療肝纖維化的主要策略之一［19-23］。

研究發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化的H S C中，血管緊張素Ⅱ的表達(dá)明顯增強(qiáng)［24］。血管緊張素Ⅱ通過(guò)促進(jìn)H S C發(fā)生，影響T G F-β，參與肝纖維化形成，在肝纖維化過(guò)程中發(fā)揮主要作用［9］。也有報(bào)道顯示，血管緊張素Ⅱ?qū) S C的調(diào)控作用與J A K2及R ho-R oc k通路有關(guān)［25-26］。血管緊張素Ⅱ引起的的肝纖維化可能與誘導(dǎo)N A D P H氧化酶依賴的氧化應(yīng)激作用有關(guān)，而血管緊張素（1-7）能夠抑制血管緊張素Ⅱ引起的肝纖維化［27］。在機(jī)體肝纖維化過(guò)程中血管緊張素Ⅱ主要是通過(guò)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)發(fā)揮作用［24］。干預(yù)H S C中腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的表達(dá)已經(jīng)成為治療肝纖維化的策略之一［28］。筆者的體外實(shí)驗(yàn)研究提示血管緊張素Ⅱ能夠上調(diào)H S C 中T G F-β1、S mad2及S mad4的m R N A及蛋白表達(dá)（P＜0.01），從而促進(jìn)H S C的增殖（P＜0.01）。

中藥川芎嗪具有抗組織纖維化、抗氧自由基、改變血液流變學(xué)、免疫抗腫瘤等功效，尤其是它的抗組織纖維化作用越來(lái)越引起人們的重視［10-14］。報(bào)道顯示，川芎嗪抑制H S C的激活與其干擾血小板源生長(zhǎng)因子β受體調(diào)控E R K及P38通路有關(guān)［29］。也有報(bào)道顯示，川芎嗪抑制H S C的激活與其抑制胰島素受體調(diào)控PI3K/A K T及E R K通路有關(guān)［30］。還有報(bào)道顯示，川芎嗪抑制H S C的激活與其對(duì)H ed g eho g信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控有關(guān)［31］。體內(nèi)研究提示，川芎嗪的抗肝纖維化作用與其對(duì)H S C細(xì)胞內(nèi)P D G F-beta R/N LR P3/C aspase1通路進(jìn)行調(diào)控從而抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)［32］。筆者的體外實(shí)驗(yàn)研究提示，鹽酸川芎嗪能夠明顯抑制由血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的H S C中T G F-β1、S mad4、S mad2的m R N A及蛋白上調(diào)（P＜0.01，川芎嗪0.20～1.00m g/ml），從而抑制H S C的增殖（P＜0.01，T MP0.04～1.00 m g/ml），且存在濃度依耐性。

綜上所述，血管緊張素Ⅱ上調(diào)H S C中T G F-β1、S mad2、S mad4的m R N A及蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)H S C的增殖；而川芎嗪對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的H S C具有抑制作用，在一定范圍內(nèi)表現(xiàn)為濃度依賴性（0.2～1.0m g/ml），提示川芎嗪的抗肝纖維化作用可能是通過(guò)其對(duì)H S C中T G F-β1/S mads通路的調(diào)控產(chǎn)生的。

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（申海菊 編輯）

Effects of Tetramethylpyrazine and angiotensinⅡ on TGF-β1/ Smads signaling pathway in rat hepatic stellate cells

Guo-wei Wei1，Ke-yue Li2
（1.General Ward for Cadre，2.Department of Hepatobiliary Surgery，the People's Hospital of Guizhou Province，Guiyang，Guizhou 550002，China）

Objective To investigate the effects of Tetramethylpyrazine and angiotensinⅡ on transforming growth factor-β1（TGF-β1）/Smads signaling pathway in rat hepatic stellate cells（HSCs）.M ethods HSCs were cultured，and then treated by angiotensinⅡ（1×10-5mol/L）or angiotensinⅡ（1×10-5mol/L）combined with different concentrations of Tetramethylpyrazine（0.04，0.20 and 2.00mg/ml）.The treated cells and control groups were incubated for 48 hours.Cell proliferation was assayed by CCK-8.Relative mRNA expressions of TGF-β1，Smad2 and Smad4 were assayed by quantitative real-time polymerase chain reaction.Relative protein expressions of TGF-β1，Smad2 and Smad4 were investigated by Western blot.Results AngiotensinⅡ significantly promoted HSC proliferation，significantly up-regulated both the mRNA and protein expressions of TGF-β1，Smad2 and Smad4 in HSCs（P＜0.01）.The effects of angiotensinⅡ in HSCs were significantly inhibited by Tetramethylpyrazine in a dose-dependent manner（P＜0.01）.Conclusions This study suggested that the antiliver fibrosis effects of Tetramethylpyrazine maybe connect with modulation of TGF-β1/Smads signaling pathway.

hepatic stellate cell；TGF-β1/Smads；Tetramethylpyrazine；angiotensinⅡ

R 285.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.009

1005-8982（2016）15-0050-06

2016-01-25