向廣韜 孫 元 羅玉子 夏水利 雷建林 仇華吉（中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱 150069）

我國豬偽狂犬病變異株研究概況

向廣韜 孫 元 羅玉子 夏水利 雷建林 仇華吉*
（中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱 150069）

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的、嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的一種烈性傳染病。在過去的幾十年里，我國通過在豬群中廣泛使用Bartha-K61 株基因缺失弱毒疫苗，使PR得到了有效控制。但自2011 年以來，在全國范圍內，許多Bartha-K61 株疫苗免疫豬群出現(xiàn)了PR疫情。研究證實，該疫情是由PRV變異株引起的，與以往毒株相比，PRV變異株致病性明顯增強，且Bartha-K61 株不能對豬只提供完全的免疫保護。目前針對PRV變異株的疫苗正在研制中，其中基因缺失活疫苗能夠對當前流行的PRV變異株提供完全的免疫保護，這些疫苗大多處于轉基因安全評價階段。在診斷方法上，已經建立了能夠有效區(qū)分Bartha-K61 疫苗株、PRV經典強毒株和變異株的三重熒光定量PCR方法。利用安全有效的基因缺失疫苗和配套的鑒別診斷技術，并結合有效的生物安全防控措施，對PR進行凈化和根除，是未來必由之路。本文對我國當前PR的流行病學、診斷方法、疫苗研制和防控策略等進行了簡述和討論。

偽狂犬??；新疫情；變異株；疫苗研制；防控

1　偽狂犬病與偽狂犬病病毒

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）又稱奧耶茨基氏病，是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的豬、羊、牛等多種家畜及野生動物的一種以發(fā)熱、奇癢（豬除外）、腦脊髓炎、呼吸和神經系統(tǒng)障礙為主要特征的急性傳染病[1]。豬是本病的貯存宿主和主要傳染源?？赏ㄟ^消化道和呼吸道水平傳播，也可通過精液、胎盤垂直傳播。不同日齡的豬均可感染，其中妊娠母豬感染后可發(fā)生流產、死胎、木乃伊胎；哺乳仔豬感染后出現(xiàn)神經癥狀、麻痹、衰竭死亡，死亡率幾乎高達100%；成年豬感染耐過后多會長期帶毒和排毒，成為最危險的傳染源，嚴重影響?zhàn)B豬生產，給PR的凈化帶來了極大的困難[2,3]。

PRV病毒粒子在電鏡下呈圓形或橢圓形，成熟的病毒粒子由內向外依次是核酸、衣殼、皮層以及囊膜[3]。PRV的基因組為雙鏈線性DNA，大小約為143 kb，G + C含量高達73%。其結構上由獨特長臂（UL）、獨特短臂（US）及US兩側的內部重復序列（IR）和末端重復序列（TR）組成。PRV編碼11種糖蛋白，即gI、gK、gL、gH、gB、gE、gD、gG、gC、gM和gN糖蛋白，其中gD、gH、gL、gB和gC糖蛋白是介導病毒粒子吸附到宿主細胞表面和病毒囊膜與細胞膜融合的蛋白[4]。PRV毒力受多個基因編碼蛋白的影響，如gE、gI、TK、gB、gC、gD、gH對PRV的毒力具有決定性的作用。

2　偽狂犬病新疫情

Bartha-K61株弱毒疫苗對我國PR的防控起到了關鍵作用，該疫苗株是將PRV強毒株經豬腎細胞、雞胚及雞胚成纖維細胞反復傳代致弱所獲得[5]，后來證實，該疫苗株為基因缺失疫苗（gE和US9基因全部缺失，gI和US2基因部分缺失）[6]。

2011 年以來，我國多個地區(qū)相繼暴發(fā)了PR，至2015年底，我國除少數地區(qū)外，均有該病暴發(fā)的報道，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經濟損失[7]。據報道，具有PR新疫情的豬場大多免疫過Bartha-K61 株弱毒疫苗；gE抗體陽性率較高；在臨床上主要表現(xiàn)為妊娠母豬流產、死胎，仔豬發(fā)病急、死亡快、死亡率高，個別感染豬還出現(xiàn)了發(fā)癢的癥狀[8-11]。

3　偽狂犬病病毒變異株的鑒定

3.1偽狂犬病病毒變異株的分子特征

此次PR新疫情暴發(fā)后，國內多家機構研究證實該疫情是由PRV變異株引起的[9,12-14]。全基因組測序分析證實，與經典的PRV毒株（如Kaplan株和Becker株等）相比，當前流行的PRV變異株多個基因存在突變（主要集中在gI、gE、gH以及間隔區(qū)序列）；基因進化樹分析顯示，新的流行毒株處于相對獨立的分支，與經典強毒株親緣關系較遠[8,12,15]。

3.2偽狂犬病病毒變異株的致病力

我國多家研究機構分離獲得了PRV變異株，并對其致病力進行了研究。與PRV經典毒株相比，新分離的PRV變異株的致病力明顯增強，具體表現(xiàn)為，對小鼠的半數致死劑量（LD50）大大降低，如TJ株的LD50為102.3TCID50，JS-2012 株的為102.37TCID50，而SC株（經典毒株）的LD50大于103.0TCID50[11,12]。由于PRV在豬體上的致病力與毒株、感染途徑、感染劑量、豬只日齡等有很大的關系，雖然有許多關于PRV變異株在豬體上的致病力的報道，但不能夠確定不同PRV變異毒株的毒力是否有差異，但與SC株相比，同等感染條件下，感染PRV變異株的豬只，出現(xiàn)臨床癥狀更早、臨床表現(xiàn)和病理剖檢變化更嚴重、死亡率更高，而相近日齡的豬只接種相同劑量的同一PRV毒株時，滴鼻途徑對豬只的致死率則明顯高于肌注途徑[11,12]。當前流行的PRV變異株最主要的特點是，Bartha-K61 株弱毒疫苗免疫豬只不能夠抵抗變異株的攻擊，表現(xiàn)為免疫豬在攻毒后出現(xiàn)發(fā)熱、排毒、個別組織器官出現(xiàn)病變[8,11,12,14,16]。不同PRV變異株與經典毒株對豬只的致病力見表1。

表1　不同PRV變異株與經典毒株對豬只的致病力

▼續(xù)表1

4　偽狂犬病病毒變異株疫苗的研制

為了控制PR新疫情，多家研究單位致力于新型疫苗的研究，在滅活疫苗和基因缺失活疫苗研制上取得了一定的進展。

4.1滅活疫苗

與活疫苗相比，滅活疫苗更加安全，不需要復雜的轉基因安全評價，因此，研究進展較快。目前，國內有3 種針對PRV變異株的滅活疫苗正處于臨床評價中。基于能區(qū)分野毒感染和疫苗免疫動物（differentiation between infected and vaccinated animals，DIVA）特性考慮，滅活疫苗所用毒株一般都進行了基因（主要是gE和gI基因）缺失，如vZJ01△gE/gI株[17]、vPRVHN1201△gE株[18]和JS-2012-△gI/gE株[19]。評價結果顯示，這些疫苗安全（接種仔豬和母豬后無任何不良反應）、能夠誘導產生針對變異株的中和抗體，并且能夠保護豬只抵抗PRV變異株的攻擊[19]。但是基于綜合評估，此類疫苗應用前景不是很樂觀，如免疫劑量大、成本高、誘導的細胞免疫反應不及活疫苗、不能阻止排毒。因此，弱毒疫苗或基因缺失活疫苗是防控變異株PR流行的主要工具，也是疫苗研制的重點。

4.2基因缺失活疫苗

PRV變異株活疫苗基本上都是基因缺失標記疫苗，缺失的基因大多是主要毒力基因如gI、gE和TK基因。相繼報道的雙基因缺失活疫苗有rPRVTJ-delgE/gI[10]、JS-2012-△gE/gI[19]，三基因缺失活疫苗有rSMX△gI/gE△TK[16]、vPRVHN1201TK-/gE-/gI-[21]和rPRVTJ-delgE/gI/TK[22]。本團隊研究結果顯示，雙基因缺失疫苗在日齡較大的仔豬上較為安全，對新生仔豬及小鼠和綿羊仍有一定的毒力；相比而言，三基因缺失疫苗無論是在綿羊、小鼠還是仔豬上均有非常高的安全性[22]。免疫效力評價結果顯示，無論是雙基因缺失疫苗還是三基因缺失疫苗，都能夠使免疫豬完全抵抗致死性PRV變異株的攻擊[16,22]。基于不同PRV變異株的疫苗免疫效力見表2。

表2　基于不同PRV變異株的疫苗對豬只的免疫效力

5　檢測方法

目前，對于當前流行的PR的診斷，主要還是基于gE/gI抗體的ELISA和基于特定基因的PCR檢測以及病毒分離鑒定。ELISA方法操作簡單，能夠對大批量的樣品進行高通量、快速的檢測，適用于疫情監(jiān)測和流行病學調查。同樣簡便易行的還有膠體金免疫層析技術（GICA），GICA是一種固相標記免疫檢測技術，可將抗原抗體的免疫學反應結果直接在固相載體上顯示出來，據此研制的檢測試紙條可實現(xiàn)快速準確的檢測，非常適合于現(xiàn)場檢測。但ELISA和GICA方法不能檢測到PRV強毒早期感染和潛伏感染，而PCR方法可達到此目的[24]。其中由本團隊建立的三重熒光定量PCR方法能夠對Bartha-K61株弱毒疫苗、PRV經典強毒株和當前流行毒株進行區(qū)分[25]。目前使用的PRV血清學方法（包括gE-ELISA）仍然可以用于變異株的檢測。

6　防控策略

盡管Bartha-K61 株等現(xiàn)行偽狂犬病疫苗不能對PRV變異株提供完全免疫保護，但還是可以提供一定交叉保護，因此適當增加免疫次數，可以提高抗體水平，減少感染和排毒。一旦出現(xiàn)PR疫情，可以用現(xiàn)行疫苗實施緊急預防接種。對于PRV變異株野毒陽性場，應當堅決淘汰PRV帶毒公豬（杜絕輸入PRV陽性精液）；對新生仔豬實行1～3 日齡滴鼻免疫，并于70～90 日齡進行加強免疫；通過適當增加免疫頻次（每年3～4 次），逐步減少gE陽性母豬的比例，待陽性率降至10%以下時，可以開始實施全群凈化措施。另外要在全場實行滅鼠、滅蚊、滅蠅行動，禁止貓狗等寵物出入，減少病毒的傳播。有條件的豬場可以試用基于PRV變異株的基因缺失疫苗。

7　結語和展望

對于我國新出現(xiàn)的PRV變異毒株，不同團隊都證實其與以往毒株不同，在遺傳進化樹上處于獨立的分支，其抗原性出現(xiàn)了變異，在基因水平和氨基酸水平上出現(xiàn)了突變。PRV變異株疫苗研究以基因缺失活疫苗為主，尤其是三基因缺失疫苗，此類疫苗安全，且能夠對當前流行的PRV變異株提供完全的保護，但該類疫苗進展緩慢，大多處于轉基因安全評價當中。在診斷方法的研制上，三重熒光定量PCR方法能夠對Bartha-K61 株弱毒疫苗、PRV經典強毒株和當前流行毒株進行區(qū)分。這些研究對PRV變異株致病機制、疫苗研制、綜合防控及凈化等方面的研究提供了良好的基礎。

對于我國PR的防控和凈化，安全高效的基因缺失活疫苗及與之配套的鑒別診斷方法將會起到至關重要的作用。另外，科學合理的生物安全防控措施也是不可忽視的。相信在政府部門、科研工作者、生物制品生產單位及養(yǎng)殖戶的共同努力下，我國PR的凈化乃至根除是可望實現(xiàn)的。

[1] Marcaccini A, López Pe?a M, Quiroga MI, et al. Pseudorabies virus infection in mink: a hostspecific pathogenesis[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2008, 124(3-4):264-273.

[2]Schoenbaum MA, Beran GW, Murphy DP. Pseudorabies virus latency and reactivation in vaccinated swine[J]. American Journal of Veterinary Research, 1990, 51(3):334-338.

[3]Pomeranz LE, Reynolds AE, Hengartner CJ. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2005, 69(3):462-500.

[4]Nauwynck HJ. Functional aspects of Aujeszky's disease (pseudorabies) viral proteins with relation to invasion, virulence and immunogenicity[J]. Veterinary Microbiology, 1997, 55(1-4):3-11.

[5]McFerran JB, Dow C. Experimental Aujeszky's disease (pseudorabies) in rats[J]. British Veterinary Journal, 1970, 126(4):173-179.

[6]Szpara ML, Tafuri YR, Parsons L, et al. A wide extent of inter-strain diversity in virulent and vaccine strains of alphaherpesviruses[J]. PLoS Pathogens, 2011, 7(10):e1002282.

[7]Sun Y, Luo Y, Wang CH, et al. Control of swine pseudorabies in China: Opportunities and limitations[J]. Veterinary Microbiology, 2016, 183:119-124.

[8]An TQ, Peng JM, Tian ZJ, et al. Pseudorabies virus variant in Bartha-K61-vaccinated pigs, China, 2012[J]. Emerging Infectious Diseases, 2013, 19(11):1749-1755.

[9]Wu R, Bai C, Sun J, et al. Emergence of virulent pseudorabies virus infection in northern China[J]. Journal of Veterinary Science, 2013, 14(3):363-365.

[10]Wang CH, Yuan J, Qin HY, et al. A novel gE-deleted pseudorabies virus (PRV) provides rapid and complete protection from lethal challenge with the PRV variant emerging in Bartha-K61-vaccinated swine population in China[J]. Vaccine, 2014, 32(27):3379-3385.

[11]Tong W, Liu F, Zheng H, et al. Emergence of a Pseudorabies virus variant with increased virulence to piglets[J]. Veterinary Microbiology, 2015, 181(3-4):236-240.

[12]Luo Y, Li N, Cong X, et al. Pathogenicity and genomic characterization of a pseudorabies virus variant isolated from Bartha-K61-vaccinated swine population in China[J]. Veterinary Microbiology, 2014, 174(1-2):107-115.

[13]Yu X, Zhou Z, Hu D, et al. Pathogenic pseudorabies virus, China, 2012[J]. Emerging Infectious Diseases, 2014, 20(1):102-104.

[14]Gu Z, Hou C, Sun H, et al. Emergence of highly virulent pseudorabies virus in southern China[J]. Canadian Journal of Veterinary Research, 2015, 79(3):221-228.

[15]Ye C, Guo JC, Gao JC, et al. Genomic analyses reveal that partial sequence of an earlier pseudorabies virus in China is originated from a Bartha-vaccine-like strain[J]. Virology, 2016, 491:56-63.

[16]Hu RM, Zhou Q, Song WB, et al. Novel pseudorabies virus variant with defects in TK, gE and gI protects growing pigs against lethal challenge[J]. Vaccine, 2015, 33(43):5733-5740.

[17]Gu Z, Dong J, Wang J, et al. A novel inactivated gE/gI deleted pseudorabies virus (PRV) vaccine completely protects pigs from an emerged variant PRV challenge[J]. Virus Research, 2015, 195:57-63.

[18]Wang T, Xiao Y, Yang Q, et al. Construction of a gE-deleted pseudorabies virus and its efficacy to the new-emerging variant PRV challenge in the form of killed vaccine[J]. Biomed Research International, 2015, 2015:684945.

[19]Tong W, Li G, Liang C, et al. A live, attenuated pseudorabies virus strain JS-2012 deleted for gE/gI protects against both classical and emerging strains[J]. Antiviral Research, 2016, 130:110-117.

[20]Yang QY, Sun Z, Tan FF, et al. Pathogenicity of a currently circulating Chinese variant pseudorabies virus in pigs[J]. World Journal of Virology, 2016, 5(1):23-30.

[21]Zhang C, Guo L, Jia X, et al. Construction of a triple gene-deleted Chinese Pseudorabies virus variant and its efficacy study as a vaccine candidate on suckling piglets[J]. Vaccine, 2015, 33(21):2432-2437.

[22]Cong X, Lei JL, Xia SL, et al. Pathogenicity and immunogenicity of a gE/gI/TK gene-deleted pseudorabies virus variant in susceptible animals[J]. Veterinary Microbiology, 2016, 182:170-177.

[23]李國新, 童武, 鄭浩, 等. 豬偽狂犬病毒變異毒株的特性及其疫苗的研究現(xiàn)狀[J]. 豬業(yè)科學, 2016, 33(1):52-53.

[24]馬力, 楊麗梅, 徐倩倩, 等. 豬偽狂犬病病毒gE蛋白在野毒診斷中的應用進展[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2014, 41(2): 249-253.

[25]Meng XY, Luo Y, Liu Y, et al. A triplex real-time PCR for differential detection of classical, variant and Bartha-K61 vaccine strains of pseudorabies virus[J]. Archives of Virology, 2016, 161(9):2425-2430.

S858.28

A

1673-4645（2016）08-0010-05

2016-06-20

仇華吉，huajiqiu@hvri.ac.cn