葛　敏，單　鋒，2，唐　碧，侯秀杰

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，安徽 蚌埠 233030；2.合肥市第四人民醫(yī)院 藥劑科，安徽 合肥 230022；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 心血管科，安徽 蚌埠 233004；4.阜陽(yáng)市第一人民醫(yī)院心血管科，安徽 阜陽(yáng) 236000)

?

二十二碳六烯酸對(duì)心房顫動(dòng)大鼠心房肌生理改變及雙孔鉀通道TASK-1蛋白表達(dá)的影響*

葛敏1，單鋒1，2，唐碧3△，侯秀杰4

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，安徽 蚌埠 233030；2.合肥市第四人民醫(yī)院 藥劑科，安徽 合肥 230022；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 心血管科，安徽 蚌埠 233004；4.阜陽(yáng)市第一人民醫(yī)院心血管科，安徽 阜陽(yáng) 236000)

目的：探討二十二碳六烯酸(DHA)對(duì)大鼠心房顫動(dòng)(AF)模型心房肌生理特性的影響及相關(guān)機(jī)制研究。方法：80只乙酰膽堿-氯化鈣混合液敏感的SD大鼠分為對(duì)照組(CTL組)、DHA處理組(DHA組)、房顫組(AF組)和房顫+DHA處理組(DHA+AF組)，觀察房顫持續(xù)時(shí)間；采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄大鼠心房肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程(APD)和雙孔鉀通道TASK-1電流，Western blot測(cè)定大鼠心房組織TASK-1蛋白表達(dá)。結(jié)果：大鼠尾靜脈注射乙酰膽堿-氯化鈣混合液后，房顫持續(xù)時(shí)間隨實(shí)驗(yàn)天數(shù)增加而逐漸延長(zhǎng)，DHA干預(yù)縮短房顫持續(xù)時(shí)間。與CTL組相比，AF組大鼠心房肌細(xì)胞復(fù)極50%時(shí)的動(dòng)作電位時(shí)程(APD50)和復(fù)極90%時(shí)的動(dòng)作電位時(shí)程(APD90)明顯縮短，心房肌細(xì)胞TASK-1電流密度升高，蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與AF組相比，DHA+AF組大鼠心房肌細(xì)胞APD50和APD90明顯延長(zhǎng)，TASK-1電流密度和蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。結(jié)論：DHA具有延長(zhǎng)房顫大鼠心房肌細(xì)胞APD的作用，可能與其下調(diào)心房肌TASK-1蛋白的表達(dá)從而降低心房肌細(xì)胞TASK-1電流密度有關(guān)。

心房顫動(dòng)；二十二碳六烯酸；心房電重構(gòu)；TASK-1；大鼠

心房顫動(dòng)(atrial fibrillation，AF)簡(jiǎn)稱房顫，是指規(guī)則有序的心房電活動(dòng)喪失，代之以快速無(wú)序的顫動(dòng)波，是臨床上最常見(jiàn)的心律失常之一，預(yù)計(jì)未來(lái)二三十年內(nèi)房顫患者數(shù)量將增至2～3倍[1]。房顫時(shí)，心房電重構(gòu)可引起空間不均一性增高以及心房?jī)?nèi)折返波長(zhǎng)縮短，導(dǎo)致房顫的發(fā)作頻率增加、持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，使得房顫更容易導(dǎo)致房顫，即“房顫致房顫”，為房顫的發(fā)生和發(fā)展提供了病理生理基礎(chǔ)。跨膜離子通道電流的改變是引起心房電重構(gòu)的基礎(chǔ)。TASK-1通道(TWIK-related acid-sensitive K+channels-1)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種雙孔鉀通道，在決定動(dòng)作電位時(shí)程(action potential duration，APD)上起到重要的作用[2-4]。新近研究提示TASK-1可能在房顫時(shí)發(fā)生了重構(gòu)，并參與了心房電重構(gòu)[5]。二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)是一種ω-3類長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，是魚(yú)油萃取物的主要成分。ω-3類長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸可以延長(zhǎng)心房有效不應(yīng)期，對(duì)心房電重構(gòu)具有改善作用[6]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，DHA可以調(diào)控人肺血管平滑肌細(xì)胞上的TASK-1，其對(duì)心房肌細(xì)胞上的TASK-1是否具有調(diào)控作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬觀察DHA對(duì)房顫大鼠心房肌生理指標(biāo)的影響，并探討該作用是否與其對(duì)TASK-1的調(diào)控有關(guān)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(合格證號(hào)：SCXK(軍)2007-012)；多克隆山羊抗TASK-1抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；兔抗山羊IgG多克隆二抗購(gòu)自武漢博士德公司；氯化乙酰膽堿、二十二碳六烯酸(DHA)、I型膠原酶、XXIV蛋白酶、EGTA、K2ATP、Na2GTP、4-aminopyridine、glibenclamide、nifedipine、E-4031、HMR1556及HEPES購(gòu)自sigma公司；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)的試劑。

1.2大鼠房顫模型的制備與分組

1.2.1大鼠房顫模型制備取健康雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，參照文獻(xiàn)[7]，篩選出對(duì)66 μg/ml乙酰膽堿-50 mg/ml氯化鈣混合液敏感的大鼠80只。造模大鼠尾靜脈注射乙酰膽堿-氯化鈣混合液，每天給藥1次，連續(xù)3 d，分析實(shí)驗(yàn)1～3 d所得心電圖，以大鼠每天尾靜脈注射乙酰膽堿-氯化鈣混合液后可誘發(fā)出典型房顫心電圖確定為大鼠房顫模型制備成功。

1.2.2分組給藥將篩選出的大鼠分為對(duì)照組(CTL組)、DHA處理組(DHA組)、房顫組(AF組)和房顫DHA處理組(DHA+AF組)，每組20只。制備大鼠房顫模型后，實(shí)驗(yàn)第4天開(kāi)始分組給藥，CTL組給予生理鹽水，DHA組給予10 mg/ml DHA溶液，AF組大鼠給予生理鹽水，1 h后再給予66 μg/ml乙酰膽堿-50 mg/ml氯化鈣混合液；DHA+AF組大鼠首先靜脈注射生理鹽水，1 h后給予66 μg/ml乙酰膽堿-50 mg/ml氯化鈣混合液，然后給予10 mg/ml DHA溶液，每天給藥1次，連續(xù)14 d。

1.3房顫持續(xù)時(shí)間測(cè)定

實(shí)驗(yàn)第3、4、10、17天，記錄大鼠尾靜脈注射乙酰膽堿-氯化鈣混合液前后標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，以給藥后心電圖顯示P波消失、出現(xiàn)f波的典型房顫心電圖作為房顫發(fā)生標(biāo)志，以恢復(fù)竇性心律、P波出現(xiàn)、f波消失作為房顫終止標(biāo)志，房顫發(fā)生至終止所持續(xù)的時(shí)間即為房顫持續(xù)時(shí)間。

1.4心房肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程(APD)與TASK-1電流測(cè)定

1.4.1分離心房肌細(xì)胞房顫持續(xù)時(shí)間測(cè)定結(jié)束后，每組取3只大鼠，剪取大鼠右心房組織，置于4℃左右氧飽和的無(wú)鈣臺(tái)氏液(137 mmol/L NaCl，11.9 mmol/L NaHCO3，5.4 mmol/L KCl，0.53 mmol/L MgCl2，0.33 mmol/L NaH2PO4，5 mmol/L HEPES，10 mmol/L?；撬幔?0 mmol/L葡萄糖)中洗凈血液，剪取約0.3 cm3大小的組織塊，置于氧飽和的EGTA液中清洗脫鈣2遍。將組織塊置于含有酶液A(1.5 mg/ml I型膠原酶，1 mg/ml XXIV蛋白酶，1 mg/ml BSA，加至無(wú)鈣臺(tái)氏液中)的試管中消化，37℃水浴30 min，通入100%的氧氣。消化完畢后，將組織塊置于含有1 ml酶液B(1.5 mg/ml I型膠原酶，加至無(wú)鈣臺(tái)氏液中)的試管中，37℃水浴5 min，通入100%的氧氣。消化完畢后，收集酶解液，800 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，將細(xì)胞保存在KB液(70 mmol/L KOH，40 mmol/L KCl，20 mmol/L KH2PO4，3 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L EGTA，10 mmol/L HEPES，50 mmol/L谷氨酸，20 mmol/L?；撬幔?0 mmol/L葡萄糖)中約1 h后即可用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

1.4.2全細(xì)胞膜片鉗記錄大鼠心房肌細(xì)胞APD與TASK-1電流(1)選取細(xì)胞：將分離好的細(xì)胞懸液滴于倒置顯微鏡上方的浴槽內(nèi)，待細(xì)胞貼壁良好后，選擇靜止、桿狀、橫紋清晰的心房肌細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(每只大鼠取8個(gè)心房肌細(xì)胞)。(2)微電極的制備及高阻抗封接形成：利用微電極拉制器經(jīng)兩步法拉制出尖端直徑約為1 μm的玻璃微電極，電極阻抗約為3～5 ΜΩ。由尖端吸入電極內(nèi)液(60 mmol/L KCl，65 mmol/L glutamate，5 mmol/L EGTA，2 mmol/L MgCl2，3 mmol/L K2ATP，0.2 mmol/L Na2GTP，5 mmol/L HEPES)，再用注射器反向沖灌，將微電極經(jīng)微電極夾持器的側(cè)管與注射器相連。用注射器向微電極加正壓，調(diào)節(jié)操縱器將微電極緩緩浸入浴液，直至接觸心房肌細(xì)胞，去掉正壓再用注射器抽吸形成10～20 cm H2O的負(fù)壓，當(dāng)封接電阻達(dá)到10 GΩ以上時(shí)，繼續(xù)施加負(fù)壓，用力吸破電極尖端的細(xì)胞，形成全細(xì)胞記錄。(3)心房肌細(xì)胞APD的記錄：應(yīng)用電流鉗方法，用Axon-200B刺激器輸出方波(波寬2 ms，頻率1 Hz，1.5倍閾強(qiáng)度電壓)驅(qū)動(dòng)標(biāo)本，引發(fā)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位，記錄并分析心房肌細(xì)胞APD50和APD90。(4)心房肌細(xì)胞TASK-1電流的記錄：電壓鉗制在-30 mV，然后去極化至+40 mV，時(shí)間為5 s(目的是失活一過(guò)性外向電流)，同時(shí)為了消除其它電流的影響，細(xì)胞灌流液(135 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，0.33 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L HEPES，10 mmol/L葡萄糖)中加入相應(yīng)通道的阻斷劑(Ito:2 mmol/L 4-aminopyridine；IKATP:2 mmol/L glibenclamide；ICa:10 mmol/L nifedipine；IKr:1 mmol/L E-4031；IKs:2 mmol/L HMR1556)，接著給予從+40 mV 至-90 mV斜波刺激(-15 mV/s)，斜波刺激結(jié)束后鉗制電位在-30 mV。不同實(shí)驗(yàn)組電流的比較采用電流密度，以消除細(xì)胞間因面積不同造成的電流誤差。注：電流密度為電流強(qiáng)度與膜電容的比值(pA/pF)。

1.5免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)TASK-1蛋白表達(dá)

實(shí)驗(yàn)第18天，房顫持續(xù)時(shí)間測(cè)定結(jié)束后，每組抽取3只大鼠，取心房組織，取50～100 mg心房組織提取總蛋白，BCA法蛋白定量后進(jìn)行SDS- PAGE電泳分離蛋白，蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液4℃封閉過(guò)夜。TASK-1一抗在37℃孵育30 min后4℃孵育過(guò)夜，將PVDF膜置入二抗工作液中室溫孵育2 h，ECL顯色曝光。采用Bio-Rad quantity one對(duì)半定量分析目的條帶的積分光密度值，相對(duì)蛋白含量用積分光密度值表示。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1DHA對(duì)大鼠房顫持續(xù)時(shí)間的影響

分析第3、4、10、17天大鼠尾靜脈注射乙酰膽堿-氯化鈣混合液前后的心電圖。結(jié)果顯示，隨實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增加，AF組與DHA+AF組大鼠的房顫持續(xù)時(shí)間逐漸延長(zhǎng)；實(shí)驗(yàn)第10、17天，與AF組相比，DHA+AF組大鼠房顫持續(xù)時(shí)間明顯縮短(P<0.05)，提示DHA可以縮短房顫持續(xù)時(shí)間(表1)。CTL組和DHA組大鼠未出現(xiàn)房顫。

DayAF DHA+AF D37.4±2.78.0±2.1D49.9±3.610.6±3.2D1029.8±4.2*18.7±4.3*△D1737.3±5.6#20.7±4.9#△

AF:Atrial fibrillation;DHA:Docosahexaenoic acid

*P<0.05 vs D4 group;#P<0.05 vs D10 group;△P<0.05 vs AF group

2.2DHA對(duì)大鼠心房肌細(xì)胞APD和TASK-1電流的影響

AF組大鼠心房肌細(xì)胞APD50為(0.83±0.09)，APD90為(0.81±0.09)，與CTL組相比明顯縮短，DHA組APD50和APD90分別為(1.25±0.14)和(1.23±0.14)，與DHA+AF組APD50(1.10±0.09)和APD90(1.11±0.10)相比明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；與AF組相比，DHA+AF組大鼠心房肌細(xì)胞APD50和APD90明顯延長(zhǎng)(P<0.05，表2)。AF組和DHA+AF組大鼠心房肌細(xì)胞TASK-1電流密度分別為(2.36±0.17)和(1.90±0.12)，與CTL組大鼠心房肌細(xì)胞TASK-1電流密度(1.65±0.14)相比明顯升高(P<0.05)，DHA組TASK-1電流密度為(1.26±0.11)，與CTL相比明顯降低(P<0.05)；與AF組相比，DHA+AF組大鼠心房肌細(xì)胞TASK-1電流密度明顯降低(P<0.05，圖1)。

GroupAPD50APD90CTL1.0±01.0±0AF0.83±0.09*0.81±0.09*DHA1.25±0.14*1.23±0.14*DHA+AF1.10±0.09*#1.11±0.10*#

APD50:Time of atrial myocyte action potential duration at 50% repolarization;CTL:Control

*P<0.05 vs CTL group；#P<0.05 vs AF group

*P<0.05 vs CTL group；#P<0.05 vs AF group

2.3DHA對(duì)大鼠心房組織TASK-1蛋白表達(dá)的影響

CTL組大鼠心房組織TASK-1蛋白與內(nèi)參GAPDH比值為(0.39±0.06)。AF組TASK-1蛋白與內(nèi)參GAPDH比值為(0.63±0.07)，DHA+AF組大鼠心房組織TASK-1蛋白與內(nèi)參GAPDH比值為(0.50±0.05)，與CTL組相比表達(dá)均明顯升高，DHA組TASK-1蛋白與內(nèi)參GAPDH比值為(0.28±0.05)，與CTL組相比有所降低(P<0.05)；與AF組相比，DHA+AF組大鼠心房組織TASK-1 蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05，圖2)。

A:The protein expressions of TASK-1 and GAPDH；B:The ratio of TASK-1/GAPDH

*P<0.05 vs CTL group；#P<0.05 vs AF group

3　討論

房顫作為臨床上最常見(jiàn)的心律失常之一，對(duì)患者可造成嚴(yán)重危害，導(dǎo)致心力衰竭等致殘致死性并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命健康[8]。由于房顫的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜且容易復(fù)發(fā)，使得房顫的長(zhǎng)期治療效果并不理想。心房肌生理特性的改變?cè)诜款澋陌l(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用，改善或逆轉(zhuǎn)房顫時(shí)的心房肌生理特性，能夠有效地抑制房顫的發(fā)生發(fā)展，目前已成為治療房顫的研究熱點(diǎn)。

有研究表明，在狗的房顫模型中ω-3 PUFAs可以改善心房電重構(gòu)[6]，但這種作用來(lái)自于哪種成分并不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，房顫大鼠心房肌細(xì)胞的APD50和APD90明顯縮短，DHA明顯延長(zhǎng)房顫大鼠的APD50和APD90，提示DHA具有改善房顫大鼠心房肌生理特性的作用。

大鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位離子機(jī)制與人相似，鈣離子、鉀離子通道電流是心房肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極化過(guò)程中的主要離子通道電流[9]。這兩種跨膜離子流發(fā)生變化，引起心房肌細(xì)胞APD縮短，易誘導(dǎo)房顫的發(fā)生[10]，調(diào)控鈣離子和鉀離子通道電流已成為抑制房顫時(shí)心房電重構(gòu)的重要環(huán)節(jié)。雙孔鉀通道是上世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)的一類鉀離子通道，能產(chǎn)生瞬時(shí)性和非失活性的電流，在所有膜電位時(shí)程中均有活性。TASK-1通道是雙孔鉀通道的重要一員，對(duì)細(xì)胞外的pH值敏感，對(duì)常用的鉀通道阻斷劑不敏感。TASK-1在心肌細(xì)胞上高表達(dá)，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的背景鉀電流和動(dòng)作電位時(shí)程、控制細(xì)胞靜息膜電位[2]。Limberg等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，ITASK-1約占人心房肌細(xì)胞背景電流的40%左右，心房肌細(xì)胞TASK-1的表達(dá)上調(diào)后心房肌細(xì)胞APD縮短；Putzke等[4]發(fā)現(xiàn)使用TASK-1阻滯劑A293后可延長(zhǎng)大鼠心室肌細(xì)胞的APD；Donner等[11]也發(fā)現(xiàn)TASK-1基因敲除小鼠的心肌細(xì)胞APD顯著延長(zhǎng)，Barth等[5]觀察到房顫患者的心房組織中TASK-1 mRNA表達(dá)水平升高，提示TASK-1可能在房顫時(shí)發(fā)生基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平的改變，從而引起通道電流的變化。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，DHA可以調(diào)控人肺血管平滑肌細(xì)胞上的TASK-1，故我們推測(cè)DHA可能通過(guò)調(diào)控心房肌細(xì)胞上的TASK-1而延長(zhǎng)房顫大鼠心房肌細(xì)胞的APD。結(jié)果顯示，房顫大鼠心房肌細(xì)胞APD50和APD90縮短的同時(shí)TASK-1電流密度及蛋白表達(dá)升高，提示房顫時(shí)心房肌細(xì)胞APD的縮短可能與TASK-1蛋白表達(dá)增高從而引起電流密度的升高有關(guān)；DHA延長(zhǎng)房顫大鼠心房肌細(xì)胞APD50和APD90，降低心房肌細(xì)胞TASK-1電流和蛋白表達(dá)，提示DHA延長(zhǎng)房顫大鼠心房肌細(xì)胞APD的作用可能通過(guò)下調(diào)心房肌細(xì)胞TASK-1蛋白表達(dá)進(jìn)而降低TASK-1的電流密度有關(guān)。值得注意的是，房顫時(shí)心房肌細(xì)胞APD的縮短是眾多離子通道電流變化引起的結(jié)果，DHA還可能通過(guò)參與調(diào)控其他離子通道電流來(lái)延長(zhǎng)心房肌細(xì)胞APD改善房顫，具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

總之，本研究表明，DHA能夠縮短房顫大鼠的房顫持續(xù)時(shí)間，延長(zhǎng)APD，其機(jī)制可能與其下調(diào)房顫時(shí)心房肌細(xì)胞TASK-1的蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制TASK-1電流有關(guān)。本研究結(jié)果可為DHA治療房顫提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of docosahexaenoic acid on atrial physiological parameter and TASK-1 protein expression in atrial fibrillation rats

GE Min1,SHAN Feng1，2,TANG Bi3△,HOU Xiu-Jie4

(1.Department of Pharmacy,Bengbu Medical College,Bengbu 233004;2.Department of Pharmacy,the Fourth People's Hospital of Hefei,Hefei 230022;3.Department of Cardiovascular Medcine,the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College,Bengbu 233004; 4.Department of Cardiovascular Medcine,the First People's Hospital of Fuyang,Fuyang 236000,China)

Objective:To investigate the effect of docosahexaenoic acid(DHA)on atrial physiological parameter and its related mechanisms in atrial fibrillation rats.Methods:Eighty Sprague-Dawley(SD)rats which were sensitive to acetylcholine-calcium chloride mixture were randomly divided into four groups:control(CTL),control treated with DHA(DHA),atrial fibrillation(AF)and atrial fibrillation treated with DHA(DHA+AF).The duration of atrial fibrillation was measured.The atrial myocyte action potential duration(APD)and TWIK-related acid-sensitive K+channels-1(TASK-1)currents were recorded by whole-cell patch-clamp technique.The expression of TASK-1 at protein level in atrial tissue was detected by Western blot method.Results:Atrial fibrillation of the rats was induced by acetylcholine-calcium chloride mixture,and the duration time of atrial fibrillation was increased with the drug-induced time prolonged.Compared with control group,the time of atrial myocyte action potential duration at 50% repolarization(APD50)and at 90% repolarization(APD90)were significantly shorten in AF group,TASK-1 current density and TASK-1 protein expression were increased(P<0.05).Compared with AF group,the duration of atrial fibrillation was decreased，the time of atrial myocyte APD50and APD90were prolonged,TASK-1 current density and protein expression were significantly reduced in DHA+AF group(P<0.05).Conclusion:DHA can prolong the atrial myocyte APD in atrial fibrillation rats,which may be related to down-regulation of TASK-1 protein expression and decreasing TASK-1 current density in atrial tissue.

atrial fibrillation;docosahexaenoic acid;atrial electrical remodeling;TASK-1

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81170046)；教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金(第46批)；安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(10040606Q44)

2015-05-11

2015-11-27

△Tel:15855798487；E-mail:bitang2000@163.com

R541.75

A

1000-6834(2016)02-128-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.009