陳麗娜，周　剛，吳　樂(lè)，侯少華

(湖南大學(xué)體育學(xué)院，長(zhǎng)沙 410082)

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NADPH氧化酶抑制劑apocynin對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠運(yùn)動(dòng)性蛋白尿的影響*

陳麗娜，周剛△，吳樂(lè)，侯少華

(湖南大學(xué)體育學(xué)院，長(zhǎng)沙 410082)

目的：研究 NADPH氧化酶抑制劑apocynin對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠運(yùn)動(dòng)性蛋白尿產(chǎn)生的影響及其機(jī)制。方法：32只SD雄性大鼠隨機(jī)分為安靜對(duì)照組(C組)、對(duì)照+藥物組(CA組)、力竭運(yùn)動(dòng)組(E組)、力竭運(yùn)動(dòng)+藥物組(EA組)。藥物注射按10 mg/kg體重，每天一次，連續(xù)3 d，并在末次藥物注射1 h后進(jìn)行一次性跑臺(tái)力竭運(yùn)動(dòng)。測(cè)定運(yùn)動(dòng)后尿UP、血液BUN水平、腎臟ROS濃度、NOS活性、NOS與3-NT蛋白含量。結(jié)果：結(jié)果顯示，E組UP、腎臟ROS、iNOS含量及活性、3-NT明顯升高，而EA組的這些指標(biāo)與C組相比無(wú)顯著性差異。結(jié)論：力竭運(yùn)動(dòng)可明顯增加腎組織NADPH氧化酶活性，從而產(chǎn)生大量的ROS，后者可迅速地與由腎臟iNOS催化生成的NO反應(yīng)，產(chǎn)生過(guò)量的ONOO-，誘發(fā)運(yùn)動(dòng)性蛋白尿的生成。

NADPH氧化酶；運(yùn)動(dòng)性蛋白尿；活性氧；過(guò)氧亞硝基陰離子；一氧化氮

自1877年Vonleub首次報(bào)告士兵行軍和野營(yíng)訓(xùn)練后出現(xiàn)蛋白尿以來(lái)，運(yùn)動(dòng)性蛋白尿的研究已有一百多年的歷史。關(guān)于運(yùn)動(dòng)性蛋白尿產(chǎn)生的機(jī)制，從氧自由基角度進(jìn)行的研究越來(lái)越受關(guān)注。來(lái)自動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體實(shí)驗(yàn)的報(bào)告已證明運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的氧應(yīng)激誘發(fā)了運(yùn)動(dòng)性蛋白尿的產(chǎn)生，然而，促使運(yùn)動(dòng)性蛋白尿生成的活性氧(reactive oxygen species,ROS)的來(lái)源及其后續(xù)作用途徑并不清楚。

NADPH氧化酶是機(jī)體細(xì)胞ROS生成的最重要途徑之一。在病理?xiàng)l件下，腎臟NADPH氧化酶活性增加，促使腎組織ROS生成增加。已有研究表明，NADPH氧化酶誘導(dǎo)的ROS也是運(yùn)動(dòng)性蛋白尿生成的重要途徑[1]。組織中過(guò)量生成的ROS可與NO反應(yīng)生成過(guò)氧亞硝基陰離子(peroxynitrite，ONOO-)，而ONOO-是比O2-更強(qiáng)的氧化劑，它可以介導(dǎo)更強(qiáng)的氧化應(yīng)激損傷。已有報(bào)道運(yùn)動(dòng)性蛋白尿生成時(shí)ONOO-增加[2]，但尚不清楚運(yùn)動(dòng)性蛋白尿伴隨的ONOO-生成是否依賴于NADPH氧化酶生成的ROS。本研究通過(guò)大鼠力竭跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)構(gòu)建運(yùn)動(dòng)性蛋白尿模型，對(duì)大鼠尾部注射NADPH氧化酶抑制劑apocynin，研究NADPH氧化酶依賴的ONOO-途徑對(duì)運(yùn)動(dòng)性蛋白尿生成的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠32只，體重240～260 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK(湘)2013-0004。分籠飼養(yǎng)，每籠4只，室溫環(huán)境為20-25℃，自由飲食、飲水，自然晝夜變化光照。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及處理方法

32只大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為安靜對(duì)照組(C組)、對(duì)照+藥物組(CA組)、力竭運(yùn)動(dòng)組(E組)、力竭運(yùn)動(dòng)+藥物組(EA組)。

運(yùn)動(dòng)模型根據(jù)Kocer[1]的實(shí)驗(yàn)改進(jìn)，采用中等強(qiáng)度一次性力竭跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，具體運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度參照Bedford[3]等人對(duì)大鼠最大攝氧量的研究。ZH-PT跑臺(tái)，購(gòu)于淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司。動(dòng)物購(gòu)入后飼養(yǎng)3 d，然后E組和EA組進(jìn)行3 d跑臺(tái)適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)，5 m/min，每天1次，無(wú)坡度。正式運(yùn)動(dòng)時(shí)以5 m/min開(kāi)始，每5 min增加5 m，直至增加到25 m/min，無(wú)坡度，持續(xù)運(yùn)動(dòng)至力竭，在整個(gè)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中用電刺激進(jìn)行強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)，電刺激強(qiáng)度小于1 mA。經(jīng)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，大鼠在力竭運(yùn)動(dòng)的時(shí)間平均在90～120 min之間，觀察到大鼠汗毛豎起，四肢癱軟，眼神無(wú)光，翻轉(zhuǎn)后無(wú)法進(jìn)行翻正反射，電刺激無(wú)法繼續(xù)運(yùn)動(dòng)即為達(dá)到力竭狀態(tài)。

力竭運(yùn)動(dòng)前兩天開(kāi)始各組大鼠進(jìn)行尾部靜脈注射，其中CA組、EA組注射NADPH氧化酶抑制劑apocynin，購(gòu)于Sigma-aldrich，STBD7270V。注射劑量為10 mg/kg體重，每天1次，連續(xù)3 d；C組、E組注射同等劑量的生理鹽水。E組和EA組在末次注射1 h后開(kāi)始一次性力竭運(yùn)動(dòng)測(cè)試。

1.3樣本的采集與處理

1.3.1血液采集一次性力竭運(yùn)動(dòng)后，立刻乙醚麻醉，用5 ml一次性無(wú)菌注射器左心室取血，即刻測(cè)定血尿素氮(BUN)。

1.3.2尿的取樣用微量注射器抽取膀胱尿液，隨即檢測(cè)尿總蛋白濃度。

1.3.3腎組織的取樣迅速取出左右兩腎，置于冰上去除脂肪及結(jié)締組織，生理鹽水沖洗余血，并用濾紙吸干水分，密封保存在-80℃超低溫冰箱中以備勻漿。稱取腎組織1 g左右放于冰上剪碎，按1 mg∶5 μl的比例加入PBS勻漿液(PH 7.4，mmol/L,磷酸5、蔗糖250、EDTA 0.1、PMSF 1和DTT 1)，勻漿后分裝兩個(gè)離心管，一管以3 000 r/min，離心10 min，取上清液分裝后-80℃保存，用于ROS、NOS活性、蛋白定量測(cè)定；另一管以12 000 r/min，離心10 min，取上清液繼續(xù)離心10 min后取上清液分裝-80℃保存，用于神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、硝基酪氨酸(3-NT)蛋白測(cè)定。

1.4指標(biāo)的測(cè)定

尿蛋白濃度(UP)：CBB法測(cè)定，試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。血尿素氮(BUN)：比色法測(cè)定，試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

腎活性氧(ROS)：采用熒光探針(DCFH-DA)檢測(cè)[4]，試劑購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。96孔板中測(cè)定孔每孔加入200 μl腎組織勻漿液，及100 μmol/L NADPH(對(duì)照孔加入等量SOD)和10 μmol/L DCFH-DA，混勻，37℃恒溫孵育30 min，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm。

腎NOS活性：采用熒光探針?lè)?DAF-2DA)檢測(cè)nNOS、iNOS、eNOS活性[4]，試劑均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。96孔板中測(cè)定孔每孔加入20 μl腎組織勻漿液,然后分別加入含NOS抑制劑(nNOS抑制劑Spermidine,iNOS抑制劑1400W，eNOS抑制劑L-NAME)的PBS 100 μl，再每孔加入100 μl DAF-2DA PBS(μmol/L L-arginine,2 mmol/L Ca2+,1 μmol/L DAF-2 DA)，37℃恒溫孵育60 min，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm。

腎NOS、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、3-NT蛋白：蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)腎臟nNOS、iNOS、3-NT蛋白含量，以GAPDH做內(nèi)參。GAPDH抗體購(gòu)于杭州賢至生物科技有限公司，nNOS、iNOS、eNOS、二抗抗體購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司，3-NT抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma-aldrich公司。

腎組織蛋白定量：采用BCA蛋白濃度測(cè)定法，試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠尿蛋白、血尿素氮的影響

由表1可見(jiàn)，通過(guò)一次性力竭運(yùn)動(dòng)，E組的尿蛋白濃度約是C組的3倍(P<0.01)，EA組UP與E組相比下降明顯(P<0.05)，表明一次性力竭運(yùn)動(dòng)可明顯導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性蛋白尿生成增加，而NADPH氧化酶抑制劑apocynin也明顯抑制了UP生成。

GroupUP(mg/L)BUN(mg/dl)C74.63±14.924.18±1.34CA60.37±8.344.04±0.20E228.16±40.26**##7.00±1.97*#EA161.39±24.75△7.47±1.45*#

C：Control group；CA：Control apocynin group；E：Exercise group；EA：Exercise apocynin group

*P<0.05，**P<0.01 vs C；#P<0.05，##P<0.01 vs CA；△P<0.05 vs E

2.2力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)腎組織ROS的影響

由圖1可見(jiàn)，一次性力竭運(yùn)動(dòng)后，E組腎臟ROS與C組相比明顯升高(P<0.05)，提示力竭運(yùn)動(dòng)可明顯增加腎臟ROS生成；EA組較E組ROS生成量亦顯著性降低(P<0.05)，表明apocynin明顯抑制了NADPH氧化酶活性，導(dǎo)致ROS生成明顯減少。

C：Control group；CA：Control apocynin group；E：Exercise group；EA：Exercise apocynin group

*P<0.05 vs C；#P<0.05 vs E

2.3力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)腎NOS的影響

腎組織的一氧化氮合酶(NOS)有nNOS、iNOS和eNOS三種亞型。分別用Spermidine,1400W和L-NAME抑制NOS的活性，檢測(cè)到E組和EA組腎iNOS活性較C組明顯增加(P<0.05)，而nNOS和eNOS的活性未見(jiàn)變化。同時(shí)，Western blot測(cè)定腎NOS蛋白，也僅見(jiàn)E組和EA組腎iNOS蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)，而nNOS和eNOS未見(jiàn)變化。力竭運(yùn)動(dòng)后iNOS蛋白表達(dá)與活性的變化見(jiàn)圖2。

2.4力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)腎ONOO-生成的影響

過(guò)氧亞硝酸陰離子ONOO-具有很強(qiáng)的氧化性，可使蛋白質(zhì)中的酪氨酸硝基化。ONOO-在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生后迅速消失，不易檢測(cè)，但可以通過(guò)檢測(cè)其反應(yīng)的產(chǎn)物3-硝基酪氨酸(3-NT)來(lái)推測(cè)其生成量。由圖3可見(jiàn)，E組較C組腎3-NT生成量顯著增加(P<0.01)，而EA組與E組相比明顯降低(P<0.05)，說(shuō)明一次性力竭運(yùn)動(dòng)明顯造成ONOO-生成量增加，而注射NADPH氧化酶抑制劑apocynin可減少ONOO-的生成。

Fig.2Effects of exhaustive exercise on iNOS protein expression and activity

C：Control group；CA：Control apocynin group；E：Exercise group；EA：Exercise apocynin group

*P<0.05 vs C；#P<0.05 vs CA

Fig.3Effects of exhaustive exercise on renal 3-NT generation

C：Control group；CA：Control apocynin group；E：Exercise group；EA：Exercise apocynin group

**P<0.01 vs C；#P<0.05 vs E

3　討論

安靜時(shí)正常人體的尿液中只有極微量的蛋白隨腎臟隨尿排出，但在急性的劇烈運(yùn)動(dòng)或長(zhǎng)期過(guò)度訓(xùn)練情況下，由于腎小球通透性增大，超出了腎小管的重吸收能力，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性蛋白尿發(fā)生[5]。本研究采用了中等強(qiáng)度的跑臺(tái)力竭運(yùn)動(dòng)，大鼠力竭時(shí)間約在90～120 min。從大鼠力竭后膀胱抽取的尿液檢測(cè)到，力竭運(yùn)動(dòng)組尿蛋白含量較安靜組上升了近2倍(P<0.01)，同時(shí)，血BUN水平也明顯升高(P<0.05)。

造成力竭運(yùn)動(dòng)后尿蛋白增加的原因，可能與運(yùn)動(dòng)引起的腎臟缺血/再灌注引起的腎功能受損有關(guān)。運(yùn)動(dòng)時(shí)，骨骼肌血流量增加，而腎血流量急劇減少，并隨運(yùn)動(dòng)過(guò)程的持續(xù)和強(qiáng)度遞增表現(xiàn)得更加明顯。由于腎血流量的下降，腎小球的濾過(guò)率隨之下降，但濾過(guò)分?jǐn)?shù)反而上升，這反而有利于血漿蛋白進(jìn)入到原尿中。并且，腎臟在缺血一段時(shí)間后，血液再灌注時(shí)氧分子重新進(jìn)入組織內(nèi)，反而使缺血造成的腎功能損傷加劇[6]。此外，在運(yùn)動(dòng)性蛋白尿增加的同時(shí)，由于腎功能受損，腎小球?yàn)V過(guò)率減少，尿素的清除率減低，致使這些含氮的產(chǎn)物在體內(nèi)蓄積而潴留，血中非蛋白含量增高，尿素排出量減少，血中尿素增加[7]。

3.1力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的蛋白尿依賴于NADPH氧化酶途徑生成的ROS

相關(guān)研究表明，腎臟的缺血/再灌注與腎臟組織ROS的生成有密切的聯(lián)系[6]，力竭運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致腎臟的氧化損傷,并進(jìn)一步導(dǎo)致了蛋白尿的形成[1]。然而，誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)性蛋白尿生成的ROS的來(lái)源及其后續(xù)的作用機(jī)制并不清楚。

近年來(lái)，一些學(xué)者提出運(yùn)動(dòng)引起的骨骼肌以外組織的ROS增加源于NADPH氧化酶[1]。在腎臟中，NADPH氧化酶成分大量表達(dá)在腎血管、腎小球系膜、足細(xì)胞致密斑、厚升支段、遠(yuǎn)端小管和集合管內(nèi)。在生理狀態(tài)下，這些細(xì)胞的NADPH氧化酶活性很低，而各種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、高血糖和脂質(zhì)代謝障礙的刺激可使此酶激活，產(chǎn)生ROS[8]，作為信號(hào)傳遞分子或自由基的來(lái)源導(dǎo)致氧化損傷[9]。apocynin是一種NADPH氧化酶的強(qiáng)抑制劑。有研究表明apocynin可以降低NADPH氧化酶活性，抑制氧化應(yīng)激，減少微量蛋白尿的分泌，延緩腎臟病進(jìn)展，在糖尿病腎病中具有保護(hù)作用[10]。本研究采用apocynin來(lái)抑制NADPH氧化酶活性，結(jié)果提示一次性力竭運(yùn)動(dòng)可明顯增加腎組織ROS的生成，而注射apocynin的力竭運(yùn)動(dòng)組由于apocynin抑制了腎組織中NADPH氧化酶活性，使ROS的生成減少。因此，可以認(rèn)為，力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的腎組織ROS生成增加，與NADPH氧化酶活性增加有關(guān)。

本研究參照了Kocer的力竭運(yùn)動(dòng)模型。在Kocer的研究中發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)性蛋白尿模型的跑臺(tái)力竭運(yùn)動(dòng)明顯造成大鼠腎臟脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物和NADPH氧化酶活性增加，而給大鼠連續(xù)4天注射diphenyleneiodonium chloride(DPI，一種NADPH氧化酶的抑制劑)，力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠腎臟NADPH氧化酶活性受抑制，ROS生成量減少，蛋白尿生成也隨之減少。推測(cè)腎臟NADPH氧化酶活性的增高可能源于力竭運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞對(duì)腎組織的浸潤(rùn),也可能是運(yùn)動(dòng)期間腎臟組織增加的自由基激活了位于腎小球的NADPH氧化酶[1]。

總之，本研究與Kocer等的研究結(jié)果均觀察到，抑制腎臟NADPH氧化酶活性可以消除力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的腎臟氧應(yīng)激的發(fā)生，并防止運(yùn)動(dòng)性蛋白尿的生成。這些研究結(jié)果表明，NADPH氧化酶活性的增加，是力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致腎臟ROS增加的一個(gè)重要來(lái)源，是誘發(fā)運(yùn)動(dòng)性蛋白尿的重要途徑。為了了解NADPH氧化酶產(chǎn)生的ROS的后續(xù)作用，即ROS是如何進(jìn)一步誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)性蛋白尿生成的，本研究從ONOO-途徑進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

3.2力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)腎臟ONOO-生成

在NO存在的情況下，O2-.可與NO反應(yīng)生成ONOO-。ONOO-具有很強(qiáng)的強(qiáng)氧化性和硝基化作用，可硝基化蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基并生成3-NT,并能改變酶活性、造成線粒體損傷及細(xì)胞凋亡。

由于ONOO-在體內(nèi)的半衰期極短，因此研究中常選擇ONOO-的生物標(biāo)志物3-NT來(lái)推測(cè)ONOO-生成量。3-NT的檢測(cè)已被廣泛地運(yùn)用于腎臟疾病的研究。在運(yùn)動(dòng)模型的研究中，李麗、田振軍等的研究均推測(cè)過(guò)度訓(xùn)練導(dǎo)致腎臟產(chǎn)生過(guò)量NO可迅速與O2-.反應(yīng)，結(jié)合生成ONOO-，并進(jìn)一步造成腎組織的過(guò)氧化損傷[11]或直接造成DNA損傷[12]。然而，前述推測(cè)國(guó)內(nèi)并未見(jiàn)實(shí)證研究。本研究通過(guò)Western blot檢測(cè)到了力竭運(yùn)動(dòng)后腎臟3-NT的變化，顯示一次性力竭運(yùn)動(dòng)可明顯增加大鼠腎組織3-NT表達(dá)(P<0.01)，而力竭運(yùn)動(dòng)+藥物組大鼠與力竭運(yùn)動(dòng)組相比3-NT表達(dá)明顯降低(P<0.05)，提示力竭運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致腎組織ONOO-增加，而通過(guò)apocynin抑制NADPH氧化酶活性后，ONOO-生成減少，說(shuō)明前述力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的NADPH氧化酶途徑生成的ROS參與了腎組織ONOO-的生成。并且，NADPH氧化酶途徑的ROS生成量、ONOO-生成量與尿蛋白的生成保持同步變化，提示ONOO-的過(guò)量生成也可能是運(yùn)動(dòng)性蛋白尿形成的誘導(dǎo)因素。

Gülsen等[2]采用大鼠連續(xù)5 d的跑臺(tái)力竭運(yùn)動(dòng)，在末次運(yùn)動(dòng)24 h之后，檢測(cè)到力竭組大鼠尿液中蛋白質(zhì)和糖類均顯著增加，同時(shí)腎曲小管部位ONOO-顯著增加。作者認(rèn)為，腎小球和腎小管是力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、糖類及類固醇排泄增加的敏感區(qū)域，ONOO-也可能主要產(chǎn)生于這些部位。來(lái)自離體的腎缺血/再灌注的研究發(fā)現(xiàn)，小劑量的ONOO-可能對(duì)腎功能產(chǎn)生生理保護(hù)效應(yīng)，而應(yīng)用大劑量的ONOO-灌注,尿鈉排泄顯著增多,提示ONOO-對(duì)腎小管的重吸收功能有損傷作用[13]。運(yùn)動(dòng)性蛋白尿形成與腎小管的重吸收能力不足有關(guān)[5]，因此力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)腎臟產(chǎn)生的過(guò)量ONOO-也可能損傷了腎小管的重吸收功能，從而導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。

為進(jìn)一步了解力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致腎臟ONOO-生成增加的NO的來(lái)源，本研究對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠腎臟中三種NOS蛋白(nNOS、iNOS、eNOS)及其活性均進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果未檢測(cè)到nNOS和eNOS蛋白表達(dá)及其活性有變化，而無(wú)論是力竭組還是力竭+藥物組，均顯示iNOS蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)，并且，與之相一致的是iNOS活性也見(jiàn)明顯增高(P<0.05)?？梢哉J(rèn)為，力竭運(yùn)動(dòng)通過(guò)激活腎臟iNOS蛋白表達(dá)及其活性，使腎臟組織內(nèi)NO生成增多。董靜梅[14]也證明了過(guò)度訓(xùn)練可激活NADPH氧化酶活性，iNOS生成增多，ROS產(chǎn)生增加，并通過(guò)補(bǔ)充谷氨酰胺可抑制NADPH氧化酶活性，減少ROS生成。

有研究表明，在腎臟缺血/再灌注過(guò)程中，可引起腎iNOSmRNA表達(dá)上調(diào)，iNOS表達(dá)增多，而力竭運(yùn)動(dòng)所致的血液重新分配即可誘發(fā)腎臟缺血/再灌注。Evans研究發(fā)現(xiàn)，腎小球cNOS蛋白含量在缺血/再灌注1 h后明顯增高，而腎小管iNOS活性在5 h后表達(dá)明顯，iNOS活性增強(qiáng)后生成過(guò)量的NO導(dǎo)致腎組織器官損傷，而這一機(jī)制可能與ONOO-的生成有關(guān)[15]。田振軍等在一項(xiàng)不同強(qiáng)度的大鼠跑臺(tái)訓(xùn)練的研究中發(fā)現(xiàn)，在運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下，NOS的3種亞型的表達(dá)均呈增高趨勢(shì)，且運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度越大，生成的NO越多，對(duì)腎臟的損傷也越大。結(jié)果表明，不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起NOS在腎臟皮質(zhì)區(qū)的表達(dá)與缺血/再灌注可誘導(dǎo)其表達(dá)的情形相一致，表明運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下NOS 在腎臟的表達(dá)類似于腎臟缺血/再灌注損傷。并進(jìn)一步推測(cè)腎臟皮質(zhì)區(qū)過(guò)量生成的NO與O2-.反應(yīng)生成更強(qiáng)氧化性的ONOO-[10]。

綜上所述，力竭運(yùn)動(dòng)可明顯增加腎組織NADPH氧化酶活性，從而產(chǎn)生大量的O2-.，后者可與主要由腎臟iNOS催化生成的NO反應(yīng)，產(chǎn)生大量的ONOO-，進(jìn)而引起運(yùn)動(dòng)性蛋白尿的生成。

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Effect of NADPH oxidase inhibitor apocynin on the exercise induced proteinuria in rats

CHEN Li-na，ZHOU Gang△,WU le,HOU Shao-hua

(College of Sport,Hunan University,Changsha 410082，China)

Objective:To investigate the effect of NADPH oxidase inhibitor apocynin on exercise-induced proteinuria and its related mechanism.Methods:Thirty-two SD rats were randomly divided into the control group(group C),control + drug group(group CA),exhaustive exercise group(group E),exhaustive exercise + drug group(group EA).The rats were administrated apocynin at 10 mg/kg weight,once a day for three days,and one hour after the drug injection,a one-time exhaustive exercise was performed.After exhaustive exercise,urine protein,blood urea nitrogen(BUN),and kidney reactive oxygen species(ROS)concentration,NOS activity,NOS and 3-NT concentration were detected.Results:In comparison to control group urinary protein(UP),ROS,inductible nitric oxide synthase(iNOS),3-NT levels increased significantly in group E while those in group EA did not change.Conclusion:The elevated renal NADPH oxidase activity by exhaustive exercise induced ROS that can rapidly react with NO,and then produces excess peroxynitrite,which contributes to occurrence of exercise-induced proteinuria.

NADPH oxidase;exercise-induced proteinuria;reactive oxygen species(ROS);peroxynitrite(ONOO-);nitric oxide

湖南省自然科學(xué)基金資助(12JJ3093)

2015-05-25

2015-11-11

△Tel：13548644844；E-mail：zg460@126.com

G804.5

A

1000-6834(2016)02-116-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.006