喬　萌，黃　欣，何云凌，周延召，韓　雪，朱玲玲△，范　明,△

(1.首都醫(yī)科大學神經生物學系，北京 100069；2.軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所認知科學研究室，北京 100850)

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缺氧對穩(wěn)定表達人淀粉樣前體蛋白HEK293細胞的存活及阿爾茨海默病相關蛋白表達的影響*

喬萌1，黃欣2，何云凌2，周延召2，韓雪1，朱玲玲2△，范明1,2△

(1.首都醫(yī)科大學神經生物學系，北京 100069；2.軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所認知科學研究室，北京 100850)

目的：探討缺氧對穩(wěn)定表達人淀粉樣前體蛋白的HEK293細胞(HEK293-APP695)存活及相關蛋白表達的影響，為深入研究缺氧對阿爾茨海默病的調節(jié)作用提供穩(wěn)定的細胞模型。方法：利用缺氧手套箱(0.3% O2)處理HEK293-APP695細胞，CCK-8法檢測細胞的存活情況；Western blot檢測缺氧條件下阿爾茨海默病(AD)相關蛋白APP、APP-CTFs和BACE1的表達變化。結果：缺氧處理后，HEK293-APP695細胞的存活率明顯下降，APP表達降低，其剪切體APP-CTFs表達升高。結論：缺氧導致APP剪切的增多，抑制細胞的存活，提示缺氧可能通過影響B(tài)ACE1的活性在AD的發(fā)病進程中起重要的調節(jié)作用。

阿爾茨海默?。蝗毖?；HEK293細胞；淀粉樣前體蛋白

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最常見的以認知障礙和癡呆為表型的神經退行性疾病[1]。其患病風險隨著年齡的增長而逐漸增加，隨著全球人口趨于老齡化，AD發(fā)病率日益增高，但目前尚缺乏有效的防治手段。AD的病理學特征主要有β-淀粉樣蛋白(beta- amyloid，Aβ)沉積在腦內形成的老年斑塊和tau蛋白過度磷酸化形成的神經纖維纏結(neurofibrilary tangles，NFTs)[2]。在諸多關于發(fā)病機制的假說中，Aβ假說處于主導地位，Aβ是構成老年斑塊的主要成分，其由淀粉樣前體蛋白(amyloid peptide precursor，APP)經APP β-位點切割酶1(Beta-site APP-cleaving enzyme1，BACE1)剪切而生成。病理條件下，Aβ異常聚集，這些聚集態(tài)的Aβ通過啟動炎癥反應、氧化應激等一系列的下游事件引起神經元的死亡，最終導致疾病的發(fā)生和發(fā)展。

缺氧指當組織的氧供應不足或用氧障礙時，導致組織代謝、功能和形態(tài)結構發(fā)生異常變化的病理過程。由于腦組織耗氧量很高，因此對氧供應不足造成的損傷更加敏感，急性缺氧時低氧誘導因子(hypoxia-induced factor 1α，HIF-1α)及其靶基因的表達上調有利于組織細胞和機體對抗缺氧造成的應激狀態(tài)，從而對機體具有一定的保護作用[3]。但長時間重度缺氧，機體會通過HIF-1α介導的信號通路誘導凋亡，造成神經損傷[4]。有研究表明，遭受過嚴重低氧或缺血的個體患AD的風險更高[5]。Sun等在2006年報道，BACE1受HIF-1α的直接調控，在低氧條件下，HIF-1α誘導BACE1表達上調從而加重AD的發(fā)生[6]。此外，Fang等報道發(fā)現急性缺氧可以通過ERK通路促進tau蛋白的磷酸化，導致神經細胞內tau蛋白的磷酸化增加[7]，缺氧造成的tau蛋白過度磷酸化有可能是Aβ的異常聚集造成的下游事件[8]。上述研究結果表明缺氧在AD發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。本研究利用穩(wěn)定表達人淀粉樣前體蛋白的HEK293-APP695細胞，建立了穩(wěn)定的缺氧模型，觀察了缺氧對細胞存活的影響，并對其缺氧處理后細胞中APP及其剪切體(amyloid peptide precursor c terminal fragments，APP-CTFs)以及BACE1的表達進行了檢測，為后續(xù)深入探討缺氧對AD發(fā)病的影響和藥物篩選提供穩(wěn)定的細胞模型。

1　材料與方法

1.1主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、G418購自Gbico公司；青/鏈霉素購自Hyclone公司；胰酶購自Sigma公司；CCK-8購自Dojindo公司；APP兔多抗、β-actin鼠單抗購自Sigma公司；BACE1兔多抗購自Cell Signal Technology公司；其他生化試劑均為國產分析純。

1.2細胞株及其培養(yǎng)

穩(wěn)定表達人淀粉樣前體蛋白HEK293細胞株(HEK293-APP695)為北京理工大學慶宏教授惠贈，該細胞穩(wěn)定表達Swedish家族突變K595N/M596L的人APP695基因。細胞培養(yǎng)基為含有10%的胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養(yǎng)基。HEK293-APP695細胞加入G418(100 μg/ml)進行篩選。細胞在37℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，取生長良好的細胞進行實驗。

1.3低氧處理

細胞傳代并置于常氧培養(yǎng)箱孵育24 h后，轉至0.3% O2低氧培養(yǎng)箱(COY laboratory products公司)處理24 h或48 h，常氧(20% O2)對照在常氧培養(yǎng)箱(Thermo公司)中培養(yǎng)。

1.4CCK-8檢測

將細胞接種于96孔板中，終密度為1×104cells/ml。缺氧處理后加入CCK-8試劑，10 μl/well。放入培養(yǎng)箱孵育3 h，在酶聯免疫檢測儀(Thermo公司)上測各孔在450 nm波長時的吸光值。

1.5Western blot檢測

收集細胞，使用含Cocktail(1∶50，Roche公司)的RIPA裂解液(普利萊公司)，置于冰上充分裂解細胞，4℃，12 000 r/min離心20 min，保留上清，以Bradford法測定蛋白總濃度，樣品凍存于-80℃貯存。取部分樣品加入5×上樣緩沖液于沸水浴中變性10 min。SDS-PAGE電泳分離蛋白后，濕轉法轉移蛋白到PVDF膜上，室溫封閉2 h，加入一抗(抗體比例：APP 1∶10 000；BACE1 1∶1 000；β-actin 1∶10 000)，4℃孵育過夜。加入二抗：羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG(Bio-Rad公司，1∶5 000)，室溫孵育2 h ，ECL顯色，暗室中膠片曝光顯影。

1.6統計學處理

2　結果

2.1穩(wěn)定表達人淀粉樣前體蛋白細胞株的特性

在正常培養(yǎng)條件下，隨著培養(yǎng)時間的延長，兩種細胞在不同時間點的存活并沒有差異(圖1 A、圖1B)。進一步通過Western blot實驗，檢測了兩種細胞中APP的表達情況，結果顯示，HEK293-APP695細胞可穩(wěn)定表達APP，其蛋白表達量明顯高于HEK293細胞(圖1C)，可作為研究AD的一種細胞模型，進行后續(xù)的研究。

Fig.1Characteristics of cultured HEK293-APP695 cells

A:Morphological observation of cells under the microscope(Olympus,bar=50 μm);B:Growth curve of cultured cells;C:Expression of APP and APP-CTFs in cells

2.2缺氧對細胞存活的影響

采用CCK-8方法比較了缺氧(0.3% O2)對細胞存活率的影響。結果顯示：缺氧處理24 h后，與常氧組相比，HEK293細胞的存活率無明顯變化，但HEK293-APP695細胞的存活率顯著下降(P<0.01)；缺氧處理48 h后，兩種細胞的存活能力均顯著下降，與對照組相比較，缺氧后HEK293-APP695細胞之間連接減少，分布疏散，缺氧促進了細胞的死亡(P<0.01，圖2)。

Fig.2Effects of hypoxia(0.3% O2)on cell survival

A:Morphological observation of cells were exposed to hypoxia(0.3% O2,bar=50 μm);B:Survival rate of cells were exposed to 0.3% O2for 24 h or 48 h(n=10)

**P<0.01 vs HEK293 group

2.3缺氧對細胞中AD相關蛋白表達的影響

利用Western blot法檢測缺氧處理后HEK293-APP695細胞中APP及其剪切體APP-CTFs和BACE1的表達變化。結果顯示：HEK293-APP695細胞中APP表達較常氧組明顯減少，而APP剪切體APP-CTFs的表達明顯升高，BACE1的表達略有升高(P<0.05，圖3，表1)。

3　討論

目前AD發(fā)病機制的研究大部分都是圍繞β-淀粉樣蛋白級聯假說進行的，該假說認為Aβ沉積形成的老年斑塊是導致AD發(fā)生的主要原因。在體內，淀粉樣前體蛋白APP有兩種蛋白分解代謝途徑。其中主要的一條代謝途徑是由α分泌酶和γ分泌酶介導的非淀粉樣剪切途徑。而另一條途徑是APP經過β分泌酶(BACE1)和γ分泌酶介導的淀粉樣剪切途徑，因為α分泌酶和β分泌酶的作用位點不一樣，所以只有在β分泌酶(BACE1)的剪切作用后才會產生Aβ[2]。因此，BACE1的異常剪切是老年斑塊形成的主要原因之一。已有研究顯示，慢性低氧可以通過增加Aβ的生成，減少Aβ的降解進而影響AD的發(fā)生。在人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞中，低氧可以降低和解整合素金屬蛋白酶10(disintegrin and metalloproteinase domain containing protein 10，ADAM10)的表達，從而降低β-分泌酶的表達，并提高BACE1的表達[9]。同時，也有研究證實，低氧可以通過調節(jié)β和γ分泌酶而使Aβ的生成增加[10]。上述研究表明，缺氧是AD發(fā)生發(fā)展的重要因素。

Fig.3Effect of hypoxia(0.3% O2)on the expression of AD-related protein in HEK293-APP695 cells

AD-relatedpro-tein20%O2-24h0.3%O2-24h20%O2-48h0.3%O2-48hAPP-FL10.694±0.120*0.928±0.1300.565±0.060*APP-CTFs11.337±0.3101.162±0.4502.161±0.350*BACE111.181±0.1731.058±0.1031.354±0.161

*P<0.05 vs 20% O2-24 h

目前體外研究AD的細胞模型主要有Aβ誘導培養(yǎng)的細胞模型和穩(wěn)定表達淀粉樣前體蛋白細胞株。研究表明，利用Aβ25-35誘導原代培養(yǎng)的海馬神經元的AD細胞模型細胞活性降低，電鏡觀察發(fā)現：細胞表面呈泡狀，核染色質凝集，凋亡小體形成，說明Aβ可以引起神經凋亡，導致細胞退變[11]。穩(wěn)定表達人淀粉樣前體蛋白的HEK293細胞系是目前較常使用研究Aβ產生和清除機制的細胞模型，其特點是反映了細胞中APP的代謝過程，而不只是局限性的評價Aβ的變化。因此，本研究工作探討了穩(wěn)定表達人淀粉樣前體蛋白HEK293細胞(HEK293-APP695)存活及相關蛋白表達的影響。細胞水平上的研究表明，缺氧(0.3% O2)明顯降低了HEK293-APP695細胞中的APP的表達，同時增加了APP-CTFs的生成，證明缺氧能夠促進APP的剪切，而APP剪切的增多有可能導致Aβ的生成增加，進而影響AD的發(fā)展，并且還觀察到BACE1在缺氧條件下的表達略有升高，缺氧有可能通過增加BACE1的活性及其它分泌酶的表達和活性而增加APP的剪切。鑒此本研究為深入探討缺氧對AD發(fā)生發(fā)展的作用提供了穩(wěn)定的細胞模型，也為后續(xù)細胞水平的藥物篩選奠定實驗基礎。

[1]Huang Y,Mucke L.Alzheimer mechanisms and therapeutic strategies [J].Cell,2012,148(6):1204-1222.

[2]王利利,納鑫,朱小楠，等.Tau/APP/PS1三轉基因小鼠模型的建立及生物學特征[J].中國應用生理學雜志,2012,28(6)：294-297.

[3]Matsuda T,Abe T,Wu JL,et al.Hypoxia-inducible factor-1alpha DNA induced angiogenesis in a rat cerebral ischemia model [J].Neurol Res,2005,27(5):503-508.

[4]Zhang X,Zhou K,Wang R,et al.Hypoxia-inducible factor 1alpha(HIF-1alpha)-mediated hypoxia increases BACE1 expression and beta-amyloid generation [J].J Biol Chem,2007,282(15):10873-10880.

[5]Peers C,Pearson HA,Boyle JP.Hypoxia and Alzheimer's disease [J].Essays Biochem,2007,43:153-164.

[6]Sun X,He G,Qing H,et al.Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression [J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(49):18727-18732.

[7]Fang H,Zhang LF,Meng FT,et al.Acute hypoxia promote the phosphorylation of tau via ERK pathway [J].Neurosci Lett,2010,474(3):173-177.

[8]Wen Y,Yang S,Liu R,et al.Transient cerebral ischemia induces aberrant neuronal cell cycle re-entry and Alzheimer's disease-like tauopathy in female rats[J].J Biol Chem,2004,279(21):22684-22692.

[9]Marshall AJ,Rattray M,Vaughan PF.Chronic hypoxia in the human neuroblastoma SH-SY5Y causes reduced expression of the putative alpha-secretases,ADAM10 and TACE,without altering their mRNA levels [J].Brain Res,2006,12(1):18-24.

[10]Li L,Zhang X,Yang D,et al.Hypoxia increases Abeta generation by altering beta- and gamma-cleavage of APP [J].Neurobiol Aging,2009,30(7):1091-1098.

[11]Loo DT,Copani A,Pike CJ,et al.Apoptosis is induced by beta-amyloid in cultured central nervous system neurons[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1999,90(18):7951-7955.

Effects of hypoxia on the survival and Alzheimer's disease-related protein expression in HEK293 cells stably expression APP695 protein

QIAO Meng1,HUANG Xin2,HE Yun-ling2,ZHOU Yan-zhao2,HAN Xue1,ZHU Ling-ling2△,FAN Ming1,2△

(1.Department of Neurobiology，Capital Medical University,Beijing 100069; 2.Department of Cognitive Science,Beijing Institute of Basic Medical Science，Beijing 100850,China)

Objective:To further study the regulation of hypoxia on Alzheimer’s disease(AD)pathogenesis,we investigate the effect of hypoxia on the effect of cell survival and expression of related proteins in HEK293 cells stably expressing APP695 Swedish mutantK595N/M596L(HEK293-APP695 cells).Methods:HEK293-APP695 cells were cultured at hypoxia condition(0.3% O2).The survival rate of HEK293-APP695 cells was measured by CCK-8 assay.The protein expression levels of APP,APP-CTFs and BACE1 were detected by Western blot.Results:The survival of HEK293-APP695 cells was obviously decreased after exposed to hypoxia.The expression of APP was reduced,and the expression of APP-CTFs was increased under hypoxia.Conclusion:Our data indicate that hypoxia accelerated cell death of HEK293-APP695 cells by increasing the cleavage of APP and production of β-secretase(β-site amyloid precursor protein cleavage enzyme1,BACE1).

Alzheimer’s disease;hypoxia;HEK293-APP695;APP

國家973計劃資助項目(2011CB910800，2012CB518200)

2015-04-07

2015-10-10

△Tel:010-66931315;E-mail:fanmingchina@126.com;linglingzhu@hotmail.com

Q189

A

1000-6834(2016)02-106-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.003