李云龍，李　儉，李昌盛，李靜輝，孟　宇，楊煥民，李士澤,△

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，2.動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319)

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冷應(yīng)激條件下豬睪丸細(xì)胞中RNA結(jié)合基序蛋白3過(guò)表達(dá)對(duì)Caspase 3表達(dá)的影響*

李云龍1，李儉2，李昌盛2，李靜輝2，孟宇2，楊煥民2，李士澤1,2△

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，2.動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319)

目的：探討冷應(yīng)激(32℃)條件下，豬睪丸(ST)細(xì)胞系中RNA結(jié)合基序蛋白3(RBM3)過(guò)表達(dá)時(shí)凋亡蛋白半胱天冬酶3(Caspase 3)表達(dá)量變化情況。方法：利用本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建的攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的RBM3過(guò)表達(dá)慢病毒載體pLenti6/V5-GW/EmGFP-RBM3和空病毒載體pLenti6/V5-GW/EmGFP-DEST分別感染ST細(xì)胞，作為過(guò)表達(dá)病毒(OEV)組和空載體病毒(EVV)組，此外還設(shè)立野生型細(xì)胞(WTC)組作對(duì)照，利用實(shí)時(shí)熒光定量RCR(qPCR)法和Western blot分析法檢測(cè)各組中RBM3 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。然后對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行37℃以及32℃(2 h、4 h，8 h)的冷應(yīng)激處理，利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)各組Caspase 3表達(dá)量的變化。結(jié)果：OEV組RBM3基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量高于EVV組和WTC組。在37℃以及32℃冷應(yīng)激實(shí)驗(yàn)(2 h、4 h，8 h)中，OEV組Caspase 3表達(dá)量顯著低于EVV組和WTC組。結(jié)論：冷應(yīng)激ST細(xì)胞中RBM3過(guò)表達(dá)能夠顯著地降低Caspase 3的表達(dá)程度，為RBM3基因具有抵抗低溫誘導(dǎo)ST細(xì)胞凋亡作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

RNA結(jié)合基序蛋白3；冷應(yīng)激；過(guò)表達(dá)；豬睪丸細(xì)胞系；半胱天冬酶3

豬對(duì)寒冷比較敏感，尤其是初生仔豬，其生存的臨界溫度為34℃。由于臨界溫度較高，仔豬體溫調(diào)節(jié)機(jī)能未發(fā)育完善。所以在出生后72 h內(nèi)因受凍而死的仔豬占很大比例。同時(shí)寒冷暴露也使豬的生產(chǎn)性能降低，易患睪丸損傷等疾病，這種情況給我國(guó)畜牧業(yè)造成的的損失不容估量[1]。當(dāng)動(dòng)物受到寒冷刺激時(shí)，大多數(shù)蛋白質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯受到抑制，但是冷休克蛋白的表達(dá)量卻顯著升高。RNA結(jié)合基序蛋白3(RNA binding motif protein 3,RBM3)是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的重要冷應(yīng)激蛋白，伴隨著冷應(yīng)激過(guò)程其表達(dá)量上調(diào)，以保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受低溫誘導(dǎo)凋亡傷害[2]。RBM3在各種細(xì)胞中的表達(dá)并不相同，其在胰腺、腎上腺、胎盤(pán)和睪丸細(xì)胞中高效表達(dá)，然而在心肌、甲狀腺細(xì)胞中則不表達(dá)。慢病毒是一群形態(tài)、生化特點(diǎn)相似，基因組結(jié)構(gòu)相近的一類(lèi)免疫缺陷性病毒,將慢病毒載體整合到宿主基因組中可實(shí)現(xiàn)基因組基因穩(wěn)定長(zhǎng)效表達(dá),并且其具有免疫原性低、感染效率高的特點(diǎn)[3]。本實(shí)驗(yàn)室[4]已成功構(gòu)建了豬RBM3過(guò)表達(dá)慢病毒載體，并初步探究了其功能。目前，豬RBM3過(guò)表達(dá)慢病毒載體在豬睪丸細(xì)胞抗低溫作用中的保護(hù)作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)RBM3過(guò)表達(dá)慢病毒載體感染豬睪丸(swine testicle，ST)細(xì)胞系，實(shí)現(xiàn)RBM3基因的過(guò)表達(dá)。并在正常溫度37℃和亞低溫32℃冷暴露不同時(shí)間，檢測(cè)凋亡蛋白Caspase 3的表達(dá)量，以探究RBM3過(guò)表達(dá)與Caspase 3表達(dá)量變化的關(guān)系以及對(duì)ST細(xì)胞凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器

氨芐青霉素購(gòu)自美國(guó)Spanish公司，胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清FBS和MEM培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，熒光定量試劑盒購(gòu)自大連寶生物有限公司，Caspase 3酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自深圳綠詩(shī)源生物技術(shù)有限公司，BCA蛋白定量試劑盒、ECL試劑盒均購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司，聚丙烯凝膠電泳SDS-PAGE配置試劑盒、二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠lgG抗體均購(gòu)自南京生興生物技術(shù)有限公司，一抗RBM3鼠抗蛋白單克隆抗體、一抗GAPDH鼠抗蛋白單克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2非慢病毒感染及重組慢病毒感染ST細(xì)胞

用收集到的慢病毒液(病毒滴度都為108PFU/ml)對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行預(yù)感染實(shí)驗(yàn)，尋找最佳的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，預(yù)達(dá)到ST細(xì)胞慢病毒感染率95%以上時(shí)，病毒最佳感染的MOI均為20。第1天，在24孔板中接種ST細(xì)胞，分為過(guò)表達(dá)病毒組(overexpression virus，OVE)，空載體病毒組(empty vector virus，EVV)和野生型細(xì)胞組(wildtype cell，WTC)三組，每組各做三個(gè)重復(fù)孔。每孔接種5～7×104個(gè)ST細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基體積100 μl，鋪板時(shí)的細(xì)胞的融合率約50%，加入慢病毒感染細(xì)胞時(shí)要求細(xì)胞的融合度約為70%。第2天，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，在細(xì)胞狀態(tài)較好的情況下開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。用移液器吸取病毒載體加入細(xì)胞培養(yǎng)液MEM中，以便得到準(zhǔn)確濃度的病毒載體稀釋液。吸棄OEV和EVV組細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗2次，然后在OEV組和EVV組培養(yǎng)孔中分別加入對(duì)應(yīng)MOI值的攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的RBM3過(guò)表達(dá)慢病毒載體pLenti6/V5-GW/EmGFP-RBM3和空病毒載體pLenti6/V5-GW/EmGFP-DEST稀釋液，在WTC組中加入純細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻后放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12 h。孵育完成后，將各組細(xì)胞培養(yǎng)液換成含10%FBS的MEM培養(yǎng)液，然后再次將24孔板放入37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，將OVE組的細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察感染效果。

1.3qPCR 檢測(cè) RBM3基因表達(dá)

感染24 h后吸棄三組細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液，加入Trizol 裂解細(xì)胞，抽提 RNA，檢測(cè) RNA 濃度及純度。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)的cDNA 作為模板，目的基因?yàn)?RBM3(GenBank登錄號(hào)為:NM_001243419)，其上游引物為Forward:5’-CCAATCCAGAACATGCTTCA -3’，下游引物為Reverse:5’-CCTCCAGGTCGACTGTCATAT-3’；內(nèi)參基因?yàn)镚APDH(GenBank登錄號(hào)為:NM_001206359)，其上游引物為Forward:5’-CTCTGGCAAAGTGGACATTG -3’，下游引物為Reverse:5’-GGGTGGAATCATACTGGAACA-3’。通過(guò) RT-PCR 預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索各引物 PCR 擴(kuò)增的最佳條件。 擴(kuò)增的RBM3片段長(zhǎng)度為199 bp，擴(kuò)增的內(nèi)參基因GAPDH片段長(zhǎng)度為86 bp。在 Eppendorf Real-plex 上以 SYBR Green 法進(jìn)行 qPCR，分析基因的表達(dá)量。反轉(zhuǎn)錄條件為：94℃預(yù)變性10 s，94℃變性5 s，56℃退火30 s，72℃延伸20 s，共45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，獲得每個(gè)樣本的Ct值，按下列公式計(jì)算△△Ct=△Ct1-△Ct2，再計(jì)算2-△△ct，即表示目的基因在處理組與對(duì)照組的相對(duì)比。其中△Ct1=目的基因?qū)嶒?yàn)組-內(nèi)參基因?qū)嶒?yàn)組，△Ct2=目的基因?qū)φ战M-內(nèi)參對(duì)照組。

1.4Western blot檢測(cè) RBM3蛋白表達(dá)

采用Western blot分析方法,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶蛋白(GAPDH)為內(nèi)參蛋白,檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組RBM3的表達(dá)情況。先提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總蛋白,然后用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度,經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜,迅速將蛋白膜放入盛有5%的脫脂奶粉溶液中室溫振蕩封閉1 h，先加入一抗(RBM3鼠抗)室溫下?lián)u床搖動(dòng)孵育2 h,再加入二抗(辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG)室溫下?lián)u動(dòng)孵育1 h,最后將 PVDF 膜經(jīng)ECL法發(fā)光顯色，利用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并且分析。

1.5ELISA法檢測(cè)冷應(yīng)激條件下ST細(xì)胞中Caspase 3的表達(dá)量

ST細(xì)胞感染慢病毒24 h后，轉(zhuǎn)為32℃亞低溫培養(yǎng)。在37℃以及32℃培養(yǎng)2 h、4 h、8 h時(shí)，分別取細(xì)胞培養(yǎng)液上清200 μl，用Caspase 3 ELISA試劑盒及分光光度計(jì)檢測(cè)Caspase 3基因的表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1重組慢病毒感染ST細(xì)胞結(jié)果

慢病毒感染24 h之后，將培養(yǎng)板置熒光顯微鏡下觀察感染效率。觀察發(fā)現(xiàn)，感染效率約為95%，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1)。

Fig.1Appearance of ST cells which were infected by virus(×20)

A：Normal microscope；B：Fluorescence microscope;ST:Swine testicle

2.2各組細(xì)胞RBM3基因表達(dá)

OEV組RBM3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量為2.45±0.10，顯著高于其他兩組(P<0.01)；WTC組和EVV組RBM3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.05和1.07±0.06，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2)。

2.3各組 RBM3蛋白表達(dá)

WTC組，EVV組和OEV組均檢測(cè)到RBM3蛋白的表達(dá)，但OEV組目的蛋白表達(dá)量顯著高于WTC組和EVV組(圖3)。

**P<0.01 vs WTC group；##P<0.01 vs EVV group

Fig.3Expression of RBM3 protein in every experimental group

1:WTC group;2:EVV group;3:OVE group;WTC:Wild type cell;EVV:Empty vector virus;OVE:Overexpression virus;RBM3:RNA binding motif protein 3

2.4冷應(yīng)激條件下ST細(xì)胞中Caspase 3表達(dá)量的變化

在正常培養(yǎng)溫度37℃以及在32℃冷應(yīng)激實(shí)驗(yàn)(2 h、4 h，8 h)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中Caspase 3表達(dá)量在EVV組和WTC組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而OEV組Caspase 3表達(dá)量顯著低于相應(yīng)溫度與時(shí)間點(diǎn)時(shí)的EVV和WTC組(P<0.05，P<0.01，表1)。

Tab.1　Expression of Caspase3 in ST cells under 37℃ and 32℃ for different times(pmol/L,±s,n=3)

WTC:Wild type cell;EVV:Empty vector virus;OVE:Overexpression virus;ST:Swine testicle

*P<0.05，**P<0.01 vs WTC group；#P<0.05，##P<0.01 vs EVV group

3　討論

研究者發(fā)現(xiàn)RBM3在機(jī)體抵御外界寒冷刺激過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，隨著環(huán)境溫度降低RBM3表達(dá)量升高，以抵抗低溫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Ferry 等[5]研究了RBM3在成肌細(xì)胞凋亡中的作用，發(fā)現(xiàn)RBM3過(guò)表達(dá)可以減少星孢菌素應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡；Chip等[6]研究發(fā)現(xiàn)，低溫應(yīng)激時(shí)神經(jīng)元中RBM3上調(diào)在低溫誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)阻止細(xì)胞凋亡中有重要作用，證實(shí)RBM3保護(hù)作用與細(xì)胞抵抗凋亡的關(guān)系。外界應(yīng)激(例如紫外照射、缺氧應(yīng)激、冷應(yīng)激等)都能引起機(jī)體或細(xì)胞迅速發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體或細(xì)胞相應(yīng)代謝水平的變化，從而保護(hù)機(jī)體或細(xì)胞免受應(yīng)激損傷[7]，體外冷應(yīng)激培養(yǎng)細(xì)胞的存活溫度為28℃～33℃，因此本實(shí)驗(yàn)選擇研究32℃不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞發(fā)生的應(yīng)激變化，通過(guò)重組慢病毒感染實(shí)現(xiàn)了RBM3基因在ST細(xì)胞中穩(wěn)定的過(guò)表達(dá)，以此為細(xì)胞模型，探討冷應(yīng)激條件下ST細(xì)胞RBM3表達(dá)量變化對(duì)細(xì)胞Caspase 3含量的影響，進(jìn)而證實(shí)RBM3抗細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。Caspase 3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，在哺乳動(dòng)物5大主要細(xì)胞凋亡途徑中發(fā)揮著舉足輕重的作用[8]。本研究實(shí)現(xiàn)了RBM3在ST細(xì)胞中基因和蛋白水平的過(guò)表達(dá)，通過(guò)37℃以及32℃不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)Caspase 3的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，Caspase 3表達(dá)量在EVV組和WTC組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而OEV組Caspase 3表達(dá)量顯著低于相應(yīng)溫度與時(shí)間點(diǎn)時(shí)的EVV和WTC組。Dresios 等[9]研究證實(shí),在37℃或32℃的情況下，RBM3通過(guò)結(jié)合60 s核糖體亞基并且改變多聚核糖體切面結(jié)構(gòu),直接影響翻譯水平從而影響蛋白質(zhì)的合成。本研究證明RBM3在正常溫度以及亞低溫條件下可能通過(guò)與Caspase 3直接或間接的作用來(lái)減少其表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的凋亡。

環(huán)境低溫直接影響畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，具體表現(xiàn)為在低溫環(huán)境下動(dòng)物生產(chǎn)能力降低、性發(fā)育減緩、機(jī)體代謝異常，動(dòng)物易患支氣管炎、關(guān)節(jié)炎、凍傷、風(fēng)濕病等疾患，嚴(yán)重時(shí)可致使動(dòng)物死亡，如應(yīng)對(duì)不利將給國(guó)民經(jīng)濟(jì)造成巨大損失。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，每年因冷暴露給全球畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億美元。因此，近年來(lái)低溫對(duì)畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成的危害引起人們的重視。然而，至今尚無(wú)有效防治冷害的方法。本實(shí)驗(yàn)從分子層面入手，初步研究了亞低溫條件下RBM3在ST細(xì)胞中過(guò)表達(dá)能夠顯著地降低凋亡蛋白Caspase 3的表達(dá)量，從而保護(hù)細(xì)胞免受低溫誘導(dǎo)的凋亡。為在寒區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展過(guò)程中制造RBM3動(dòng)物制劑，保護(hù)動(dòng)物免受低溫凍傷提供理論依據(jù)。

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Effect of RNA binding motif protein 3 overexpression on Caspase 3 expression in swine testiclar cell under cold exposure

LI Yun-long1，LI Jian2，LI Chang-sheng2，LI Jing-hui2，MENG Yu2，YANG Huan-min2，LI Shi-ze1,2△

(1.College of Life Science and Technology,2.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China)

Objective:To investigate the change of apoptosis protein(Caspase 3)expression when RNA binding motif protein 3(RBM3)overexpression in swine testicle(ST)cell line under cold stress(32℃)condition.Methods:In present study,RBM3 overexpression lentiviral vector(pLenti6/V5-GW/EmGFP-RBM3)and empty viral vector(pLenti6/V5-GW/EmGFP-DEST)with green fluorescent protein(GFP)that were successfully constructed in our laboratory were transfected into ST cells as overexpression virus group(OEV),empty vector virus(EVV)group and establishment of wildtype cell(WTC)group as the control group.The real-time fluorescence quantitative RCR(qPCR)and Western blot were used to detect expression of RBM3 mRNA and protein in each group,then cells in each group were cultured at 37℃ or 32℃(2 h,4 h,8 h),the changes of Caspase 3 expression in each group were detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Results:Relative RBM3 gene and protein expression in OEV group were significantly higher than those in EVV group and WTC group.At the temperature of 37℃ and at 32℃(2 h,4 h,8 h)in cold stress experiment,Caspase 3 expression in OEV group was significantly lower than those in EVV group and WTC group.Conclusion:RBM3 overexpression in ST cell line exposured to cold can significantly decreased the level of Caspase 3 expression,this study provides an experimental basis of RBM3 resistance against apoptosis of ST cells induced by low temperature.

RNA binding motif protein 3；cold stress；overexpression；swine testicular cell line；Caspase 3

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272524)；農(nóng)業(yè)部948計(jì)劃重點(diǎn)資助項(xiàng)目(2011-G35)；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C201103)；研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(YJSCX2014-Y25)

2015-01-07

2015-09-30

△Tel：0459-6819230；E-mail：lishize1@sina.com

Q494

A

1000-6834(2016)02-102-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.002