周開宇， 吉海龍， 史鵬飛

(溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 神經(jīng)外科， 浙江 溫州 325000)

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苦參堿對體外人髓母細(xì)胞瘤D341細(xì)胞凋亡、增殖及凋亡相關(guān)蛋白的影響*

周開宇△， 吉海龍， 史鵬飛

(溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 神經(jīng)外科， 浙江 溫州 325000)

目的：探討苦參堿在體外對人髓母細(xì)胞瘤D341細(xì)胞的凋亡、增殖作用及相關(guān)蛋白Caspase 3、Caspase 9表達(dá)的影響。方法：D341細(xì)胞體外成功培養(yǎng)后，按所加苦參堿的濃度進(jìn)行分組(0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml、2.0 mg/ml， 0 mg/ml為對照組)，各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。光學(xué)顯微鏡、透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)的改變，CCK-8法檢測D341細(xì)胞增殖的影響，Annexin-V FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。Western blot檢測苦參堿作用D341細(xì)胞后Caspase 3、Caspase 9蛋白表達(dá)水平的改變。結(jié)果：在苦參堿作用下，細(xì)胞增殖的抑制率隨藥物濃度的增加而逐漸升高，抑制率有統(tǒng)計學(xué)差別(P<0.01)；藥物作用時間不同對細(xì)胞增殖的抑制程度不同，24 h與72 h組的抑制率有統(tǒng)計學(xué)差別(P<0.01)。瘤細(xì)胞的凋亡率隨著藥物濃度的增加而逐漸升高，0.5 mg/ml、1.0 mg/ml與1.5 mg/ml、2.0 mg/ml組間的差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；瘤細(xì)胞的凋亡率隨著作用時間延長而升高，24 h與72 h、48 h與72 h組間的凋亡率的差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著苦參堿濃度的增加，細(xì)胞Caspase 3 和Caspase 9的表達(dá)均逐漸增強(qiáng)(P<0.01)。結(jié)論：苦參堿在體外對D341細(xì)胞是通過上調(diào)Caspase 3和Caspase 9蛋白來發(fā)揮其促凋亡、抑制增殖作用。【關(guān)鍵詞】 苦參堿；人髓母細(xì)胞瘤D341細(xì)胞；凋亡；增殖；Caspase 3；Caspase 9

中藥在我國醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)中獨(dú)具特色，一直是新藥先導(dǎo)化合物和新藥發(fā)現(xiàn)的重要資源。目前，人們對苦參堿藥物作用研究較多[1]。但是，苦參堿對于人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的作用人們知之很少。髓母細(xì)胞瘤是一種好發(fā)于兒童后顱窩的惡性程度極高的腫瘤，占兒童顱內(nèi)腫瘤的第二位 (18%～20%)，手術(shù)可切除，但較易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差[2]。因此，找尋一種對此腫瘤有效的抗瘤藥物具有很好的臨床應(yīng)用前景。本研究探討人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系D341細(xì)胞在苦參堿作用下Caspase 3、Caspase 9相關(guān)蛋白的變化，通過體外實(shí)驗(yàn)檢測苦參堿對D341細(xì)胞的作用，為探索中成藥對人髓母細(xì)胞瘤的治療提供一點(diǎn)思路。

1　材料與方法

1.1材料

細(xì)胞株D341由北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞庫提供，苦參堿由寧波天衡制藥有限公司提供，光鏡采用日本Nikon倒置相差顯微鏡，透射電子顯微鏡(日本 JEM-1011)，酶標(biāo)儀(美國 BioTek EL-x800)，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、全蛋白抽提試劑盒、WB封閉液、ECL檢測試劑盒、Caspase 3、Caspase 9抗體均由上海藍(lán)基生物科技有限公司提供。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將D341細(xì)胞株接種于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2、濕潤空氣的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞分組將體外成功培養(yǎng)的D341細(xì)胞，其中24 h組初始培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)1×106cells/ml， 48 h組初始培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)5×105cells/ml，72 h組初始培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)1×105cells/ml。按苦參堿濃度，分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。在實(shí)驗(yàn)組中苦參堿濃度分別為0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml和2.0 mg/ml，對照組中不加苦參堿。

1.2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察采用日本Nikon倒置相差顯微鏡對實(shí)驗(yàn)組、對照組的培養(yǎng)皿中的瘤細(xì)胞在藥物作用24 h、48 h、72 h的生長情況，細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.2.4細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察實(shí)驗(yàn)組中苦參堿濃度為2.0 mg/ml，將實(shí)驗(yàn)組、對照組中的瘤細(xì)胞，在24、48、72 h后分別離心(1 000 r/min×5 min)，收集、洗滌、固定、脫水、包埋、切片，電鏡觀察。

1.2.5CCK-8法檢測苦參堿對D341細(xì)胞增殖的影響取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入苦參堿濃度分別為0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml和2.0 mg/ml，對照組不加苦參堿。每孔分別加入100 μl體外成功培養(yǎng)的細(xì)胞，根據(jù)作用時間不同所取初始細(xì)胞培養(yǎng)的個數(shù)同1.2.2，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，最終形成含5×107cells/ml細(xì)胞的懸液；取10 μl CCK-8分別加入各孔中，再培養(yǎng)3 h，混勻10 min，波長450 nm，以酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度，試驗(yàn)重復(fù)3次，計算抑制率。

1.2.6Annexin-V FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡按組別在六孔培養(yǎng)板各孔中分別加入含苦參堿的濃度同1.2.5培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，洗滌、離心(2 000 r/min，5 min)、收集細(xì)胞，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，再加入5 μl Annexin V-FITC、5 μl Propidium Iodide搖勻，避光、室溫下反應(yīng)5～15 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.7Western blot檢測瘤細(xì)胞Caspase 3、Caspase 9蛋白的表達(dá)取24孔培養(yǎng)板，每孔分別加入含苦參堿的濃度同1.2.5培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，分別收集細(xì)胞，冰上裂解30 min，提取蛋白，以BCA法進(jìn)行蛋白濃度的定量測定。常規(guī)制膠、上樣、蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。Ⅰ抗：Caspase 3 (1∶1 000)、Caspase 9 (1∶500)、β-actin(鼠抗1∶1 000)，4℃孵育過夜。洗膜 3次, 每次10 min。將膜與HRP結(jié)合的Ⅱ抗(辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔)(1∶5 000) 室溫下?lián)u蕩孵育2 h，再充分洗膜、漂洗3次，每次10 min。顯色、曝光、顯影、定影、光密度掃描，以β-actin作內(nèi)參照。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1形態(tài)學(xué)觀察

在相差顯微鏡下觀察活細(xì)胞生長情況。對照組細(xì)胞生長良好，胞體呈圓形、生長呈成簇性。在藥物作用下，細(xì)胞生長較分散、稀疏狀、細(xì)胞變形、破碎,甚至有壞死細(xì)胞出現(xiàn)。隨著藥物濃度增加(圖1)，作用時間延長(圖2)，這種現(xiàn)象更加明顯。

Fig. 1D341 cell morphological observation by inverted phase contrast microscope with the effect of matrine(×100)

A: Control; B: 0.5 mg/ml; C: 1.0 mg/ml; D: 1.5 mg/ml; E: 2.0 mg/ml

Fig. 2D341 cell morphological observation by inverted phase contrast microscope with the effect of matrine(2.0 mg/ml) (×100)

A: 24 h; B: 48 h; C: 72 h

2.2超微結(jié)構(gòu)的觀察

對照組細(xì)胞膜完整、染色質(zhì)分布均勻。實(shí)驗(yàn)組中苦參堿濃度為2.0 mg/ml，藥物作用 24 h，細(xì)胞體積相對變小，有“氣穴樣空泡”結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。藥物作用48 h，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮明顯，部分細(xì)胞核濃縮呈新月狀附在核膜周圍，細(xì)胞胞漿中可見“空泡”樣結(jié)構(gòu)數(shù)量增多，體積增大。藥物作用 72 h，細(xì)胞核固縮明顯，核裂解在部分細(xì)胞中可呈現(xiàn)，空泡明顯增大(圖3)。

Fig. 3D341 cell ultrastructure observation with transmission electron microscope (×50 000)

A: Control; B: 24 h; C: 48 h; D: 72 h

2.3苦參堿對D341細(xì)胞增殖的抑制作用

與對照組比較，藥物濃度不同對細(xì)胞增殖的抑制程度不同，增殖抑制率隨藥物濃度的增加而逐漸升高，不同濃度的抑制率有統(tǒng)計學(xué)差別(P<0.01)。藥物作用時間不同對細(xì)胞增殖的抑制程度不同，24 h與72 h組的抑制率有統(tǒng)計學(xué)差別(P<0.01)，但48 h與72 h、24 h與48 h組抑制率的差別卻無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

2.4苦參堿對D341細(xì)胞的凋亡作用

瘤細(xì)胞的凋亡率隨著藥物濃度的增加而逐漸升高，隨著作用時間延長而升高。其中0.5 mg/ml與1.0 mg/ml、1.5 mg/ml 與2.0 mg/ml組間凋亡率的差別無統(tǒng)計學(xué)意義，但是0.5 mg/ml、1.0 mg/ml與1.5 mg/ml、2.0 mg/ml組間的差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。24 h與48 h組間的差別無統(tǒng)計學(xué)意義，但24 h與72 h、48 h與72 h組間的差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05， 表2)。

Tab. 1Inhibition effect of matrine on D341 cell

GroupInhibitioneffect(%)24h48h72hControl0000.5mg/ml10.50±1.81**11.60±2.06**12.70±1.71**○○1.0mg/ml21.30±2.11**##27.60±2.24**##28.30±2.85**##○○1.5mg/ml31.60±2.36**△△37.00±2.24**△△47.50±2.05**△△○○2.0mg/ml38.00±2.26**▲▲47.20±2.51**▲▲59.30±2.21**▲▲○○

**P<0.01vscontrol group;?##P<0.01vs0.5 mg/ml group;?△△P<0.01vs1.0 mg/ml group;?▲▲P<0.01vs1.5 mg/ml group;?○○P<0.01vs24 h group

Tab. 2Effect of matrine on D341 cell apoptosis

GroupApoptosis(%)24h48h72hControl3.31±0.065.09±0.085.74±0.090.5mg/mL23.03±0.1024.20±0.0925.33±0.08△▲1.0mg/mL27.38±0.1031.24±0.0738.33±0.08△▲1.5mg/mL31.91±0.07*#38.22±0.09*#48.30±0.08*#△▲2.0mg/mL36.88±0.08*#44.90±0.07*#56.10±0.09*#△▲

*P<0.05vs0.5 mg/ml group;?#P<0.05vs1.0 mg/ml group;?△P<0.05vs24 h group;?▲P<0.05vs48 h group

2.5Caspase 3、Caspase 9蛋白表達(dá)水平的變化

Caspase 3、Caspase 9的蛋白表達(dá)水平隨著苦參堿濃度的增加，表達(dá)逐漸增強(qiáng)(P<0.01，表3)。

Tab. 3　Caspase 3 and Caspase 9 expression of D341 cells observed by Western blott

**P<0.01vscontrol group;?##P<0.01vs0.5 mg/ml group;?△△P<0.01vs1.0 mg/ml group;?▲▲P<0.01vs1.5 mg/ml group

3　討論

中藥廣泛的抗腫瘤活性已被人們越來越多的認(rèn)識。本文研究的苦參堿是苦參等豆科槐屬植物中生物堿的有效成分，具有抗腫瘤效應(yīng)，但其對人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的作用少有報道。人們對中藥的抗腫瘤機(jī)制主要集中在藥物抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的變化[3]。

髓母細(xì)胞瘤的不良預(yù)后[4]，也是學(xué)者不斷研究此腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的動力。本研究以人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系為靶細(xì)胞，觀察苦參堿在體外對該細(xì)胞的誘導(dǎo)作用。苦參堿在體外對人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞具有明顯的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。藥物濃度不同對細(xì)胞增殖的抑制程度不同，增殖抑制率隨藥物濃度的增加而逐漸升高，不同濃度的抑制率有統(tǒng)計學(xué)差別。瘤細(xì)胞的凋亡率隨著藥物濃度的增加而逐漸升高，隨著作用時間延長而升高。我們用光鏡觀察了在藥物作用下細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，用透射電鏡觀察了在藥物作用下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。在藥物作用下，細(xì)胞生長變得稀疏、分散、細(xì)胞變形、破碎,甚至有壞死細(xì)胞出現(xiàn)。隨著藥物濃度增加，作用時間延長，這種現(xiàn)象更加明顯，而無藥物作用組細(xì)胞卻生長良好。而透射電鏡也見證了細(xì)胞凋亡過程的發(fā)生：藥物作用下瘤細(xì)胞出現(xiàn)“氣穴樣”空泡結(jié)構(gòu)，細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、邊緣化，作用時間越長，細(xì)胞核固縮越明顯，部分細(xì)胞可見核裂解，空泡明顯增大。

細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，不同的凋亡途徑最終都需激活的Caspase參與，Caspase主要通過與IAPs 結(jié)合導(dǎo)致活性喪失而抑制細(xì)胞凋亡[5]。Caspases家族是一組存在于胞質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，能特異地斷開天冬氨酸殘基后的肽鍵，從而使它們具有能夠高度選擇性地切割某些蛋白質(zhì)功能，一直被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡中心的執(zhí)行者，現(xiàn)已確定至少存在11種Caspase，而Caspase 9被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的起始者，Caspase 3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡下游的關(guān)鍵執(zhí)行者，兩者之間存在著上下游關(guān)系，即起始者活化執(zhí)行者[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7，8]：Caspase 3處于細(xì)胞凋亡信號通路下游，經(jīng)過經(jīng)典的細(xì)胞內(nèi)外凋亡途徑促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，其可直接作用于Caspase 3、促使下游的Caspase 3等被激活降解底物使細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿藥物作用于D341細(xì)胞，隨著苦參堿濃度的增加，細(xì)胞Caspase 3、Caspase 9的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。也就是說，苦參堿對D341細(xì)胞的凋亡作用存在著一定的劑量依賴性，藥物濃度增加，其凋亡作用也逐漸增強(qiáng)，這與文獻(xiàn)表達(dá)是一致的。Yan F等[9]曾對大鼠骨肉瘤UMR-108細(xì)胞進(jìn)行研究，認(rèn)為：苦參堿抑制大鼠骨肉瘤UMR-108的生長，誘導(dǎo)線粒體Caspase依賴的凋亡途徑，使用苦參堿后瘤細(xì)胞Caspase 3、Caspase 9蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)。Tan C等[10]研究認(rèn)為：苦參堿對人類非小細(xì)胞癌的作用主要是通過Caspase起作用的凋亡途徑，并呈劑量的依賴性。Dai ZJ等[11]則認(rèn)為：苦參堿能抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和在體外誘導(dǎo)凋亡作用，其主要是通過激活Caspase 3的表達(dá)。

因此，深入研究苦參堿對人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制，為中成藥物治療人髓母細(xì)胞瘤的治療領(lǐng)域具有廣泛且深遠(yuǎn)的臨床意義和應(yīng)用前景。

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Effect of matrine on cell apoptosis and proliferation and the apoptosis related proteins of human medulloblastoma D341cells in vitro

ZHOU Kai-yu△, JI Hai-long, SHI Peng-fei

(Department of Neurosurgery, The First Clinical Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China)

Objective: To investigate the apoptosis and proliferation effect of matrine on human medulloblastoma cell line D341 in vitro and the effect of the expression of the related caspase 3 and caspase 9 proteins. Methods: The D341 cells were cultivated successfully in vitro.Then the cells were divided into 5 groups according to the concentration of matrine(0.5 mg/ml group, 1.0 mg/ml group, 1.5 mg/ml group, 2.0 mg/ml group and the control group was 0 mg/ml). All the experiments were repeated three times. The cell morphologic and structure change was observed with the optical microscope and the transmission electron microscope. The proliferation of D341 cell was analyzed using Cell Counting Kit-8 assay. Apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI double staining. The expression of Caspase3 and Caspase9 was detected by Western blot． Results: With the effect of matrine, the proliferation inhibition rate gradually increased with drug concentrations increasing, and there was a significant difference (P<0.01). The inhibitory effect of matrine on cell proliferation was different with the different treatment time, there was a significant difference between the 24 h to 72 h groups (P<0.01). The apoptotic rate increased with matrine concentrations increasing. There were significant differences between the group of 0.5 mg/ml or 1.0 mg/ml to the group of 1.5 mg/ml or 2.0 mg/ml (P<0.05). The apoptotic rate increased with the prolonged treatment time. There were significant differences between the group of 24 h or 48 h to the group of 72 h (P<0.05). With the increase of matrine concentration,the expression of Caspase 3 and Caspase 9 increased (P<0.01). Conclusion: Matrine induces the apoptosis, and inhibits the proliferation of human medulloblastoma D341 cells in vitro by up-regulation of the expression level of Caspase3, Caspase9.

matrine;human medulloblastoma D341cell;apoptosis;proliferation;Caspase 3;Caspase 9

浙江省中醫(yī)藥管理局科技計劃資助項(xiàng)目(2013ZA133、2015ZB133)

2015-05-05

2015-07-09

△Tel：13957680507; E-mail：kerry2000year@163.com

R338

A

1000-6834(2016)01-074-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.019