楊　銳， 賈　強(qiáng)， 劉小粉， 高　琴， 王　蕾， 馬善峰

(蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 安徽 蚌埠 233030)

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硫化氫對(duì)大鼠糖尿病心肌病氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響*

楊銳， 賈強(qiáng)， 劉小粉， 高琴， 王蕾， 馬善峰△

(蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 安徽 蚌埠 233030)

目的：觀察外源性給予硫化氫(H2S)供體硫氫化鈉(NaHS)對(duì)大鼠糖尿病心肌病氧化應(yīng)激作用以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)的影響。方法：將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、糖尿病組和治療組(n=10)。采用腹腔注射鏈脲佐菌素的方法制備大鼠糖尿病模型，治療組采用腹腔注射給予NaHS干預(yù)治療。12周后，利用離體心臟灌流裝置測(cè)定心室動(dòng)力學(xué)指標(biāo)；透射電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化；測(cè)定心肌組織脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的活性； RT-PCR檢測(cè)C/EBP 同源蛋白(CHOP)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)和半胱天冬蛋白酶12(Caspase 12)基因表達(dá)。 結(jié)果：與對(duì)照組比較，糖尿病組心功能明顯降低、心肌超微結(jié)構(gòu)損傷明顯，心肌組織MDA含量增加、SOD和GSH-Px的活性明顯降低，CHOP、GRP78和Caspase 12 mRNA表達(dá)明顯增加。與糖尿病組比較，治療組心功能和心肌超微結(jié)構(gòu)損傷明顯改善，心肌組織MDA含量下降，SOD和GSH-Px的活性明顯升高，CHOP、GRP78和Caspase 12 mRNA表達(dá)明顯下降。結(jié)論：外源性補(bǔ)充H2S對(duì)糖尿病大鼠心肌病具有保護(hù)作用，機(jī)制可能與減輕氧化應(yīng)激損傷和抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)的凋亡作用有關(guān)。

硫化氫；糖尿病心肌?。淮笫?；氧化應(yīng)激；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病并發(fā)的特異性心肌病，表現(xiàn)為心肌肥厚、心肌纖維化，心臟收縮和舒張功能全面下降，易并發(fā)心力衰竭及心律失常，是糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥[1]。其發(fā)生機(jī)制至今尚未完全闡明，但有很多證據(jù)顯示與氧化應(yīng)激作用及細(xì)胞凋亡作用相關(guān)[2,3]。氧化應(yīng)激作用是由于體內(nèi)的促氧化作用大于抗氧化作用而引發(fā)的損傷。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可以介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[4]，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose- regulated protein 78，GRP78)是ERS的經(jīng)典標(biāo)志物，當(dāng)ERS發(fā)生時(shí)，GRP78蛋白大量表達(dá)，并激活C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)和半胱天冬蛋白酶12(Caspase 12)的活化等，引起細(xì)胞的程序性死亡[5]。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是新型第三種氣體信號(hào)分子，并參與心血管系統(tǒng)生理功能的調(diào)控[6]。目前已發(fā)現(xiàn)外源性補(bǔ)充H2S的供體硫氫化鈉(sodium hydrosulfide, NaHS)可以減輕氧化應(yīng)激損傷以及抗心肌細(xì)胞凋亡的作用[7,8]，但是它在糖尿病心肌病氧化應(yīng)激和ERS介導(dǎo)的凋亡中的作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠糖尿病心肌病模型，研究H2S對(duì)大鼠糖尿病心肌病氧化應(yīng)激以及ERS相關(guān)蛋白基因表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討H2S對(duì)糖尿病大鼠心肌病的保護(hù)機(jī)制是否與減輕氧化應(yīng)激損傷和抑制ERS引發(fā)的凋亡作用有關(guān)。

1　材料與方法

1.1材料

鏈脲佐菌素(steptozotocin，STZ)和NaHS(美國(guó)Sigma公司)；丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RNAiso Plus試劑和RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)；PCR試劑盒(Fermentas公司)；CHOP、GRP78、Caspase 12和GAPDH引物(上海生工生物工程股份有限公司)。所用CHOP引物：上游5’- GTG TTC CAG AAG GAA GTG CA -3’，下游5’- CTC CTG CAG ATC CTC ATA CC -3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為150 bp；GRP78引物：上游5’- CGC GCT CGA TAC TGG CTG TGA CTA -3’，下游5’- TTC ATC TTG CCG GCG CTG TG -3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為168 bp；Caspase 12引物：上游5’- TCA AAG CAG AGC CCT GTG TT -3’，下游5’- TGC AGG ATT CTT GGA CAT AA -3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為164 bp；GAPDH引物：上游5’- ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC -3’，下游5’- TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA -3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為452 bp。

1.2動(dòng)物分組及處理

雄性SD大鼠30只(蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重160～200 g，隨機(jī)均分為對(duì)照組、糖尿病組和治療組(n=10)。糖尿病組和治療組大鼠空腹12 h后，一次性腹腔注射STZ 55 mg/kg，72 h后尾靜脈采血測(cè)血糖濃度，血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠。治療組在糖尿病動(dòng)物模型建立成功后第5周起，腹腔注射NaHS溶液(使用前新鮮配制，濃度為10 mmol/L) 14 μmol/kg，體積1.4 ml/kg；對(duì)照組和糖尿病組腹腔注射同劑量生理鹽水，每天1次，共持續(xù)8周。

1.3左心室功能評(píng)價(jià)

12周末，大鼠斷頭后取心臟，迅速將其固定在Langendorff灌流裝置上。用95% O2+5% CO2的混合氣飽和Krebs-Henseleit液，恒溫(37℃)恒壓(10.13 kPa)進(jìn)行灌流。左心室舒張末壓穩(wěn)定在0.53 ～1.07 kPa之間[8]。MedLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄左心室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)和左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率(maximal rise/fall rate of left ventricular pressure，±dp/dtmax)等各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4心肌超微結(jié)構(gòu)觀察

取心肌，制成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，放入2.5%戊二醛中固定，JEM-1230型透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)。

1.5生化指標(biāo)檢測(cè)

取心肌組織嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別測(cè)定MDA含量、SOD和GSH-Px活性。

1.6RT-PCR檢測(cè)CHOP、GRP78和Caspase 12 mRNA表達(dá)

采用RNAiso Plus試劑提取心肌組織總RNA。以總RNA為模板，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以此cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min后，以95℃ 變性50 s，CHOP退火溫度54.9℃ 45 s，GRP78退火溫度57.8℃ 45 s，Caspase 12退火溫度53.3℃ 45 s，GAPDH退火溫度54.7℃ 45 s；72℃ 50 s，反應(yīng)32個(gè)循環(huán)，最后一輪72℃延伸10 min。取5 μl PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。在GIS凝膠處理系統(tǒng)中拍攝，用電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)計(jì)算各目的基因與內(nèi)參基因條帶光密度比值(CHOP/GAPDH；GRP78/GAPDH；Caspase-12/GAPDH)表示mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1左心室功能指標(biāo)比較

與對(duì)照組比較，糖尿病組LVDP和±dp/dtmax明顯降低(P<0.01)。外源性補(bǔ)充H2S后，治療組LVDP和±dp/dtmax均顯著升高(P<0.01，表1)。

GroupLVDP(kPa)+dp/dtmax(kPa/s)-dp/dtmax(kPa/s)Control10.22±1.66337.64±48.72189.67±34.33Diabe-tes4.32±1.18**152.90±35.79**74.65±26.07**Treat-ment6.75±1.46##234.45±34.48##125.33±29.49##

LVDP: Left ventricular developed pressure; ±dp/dtmax: Maximal rise/fall rate of left ventricular pressure

**P<0.01vscontrol group；?##P<0.01vsdiabetes group

2.2心肌超微結(jié)構(gòu)變化

電鏡下，對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞肌原纖維排列整齊、規(guī)則，胞漿內(nèi)有豐富的線粒體，線粒體嵴密集、排列規(guī)則；糖尿病組大鼠心肌肌原纖維排列紊亂、斷裂、甚至溶解，線粒體嵴模糊不清，有大量空泡產(chǎn)生；治療組心肌損傷明顯減輕，肌原纖維排列較整齊，部分線粒體嵴排列較規(guī)則，有少量空泡產(chǎn)生(圖1)。

Fig. 1Transmission electron microscopy of myocardium in rats(×20 000)

A：Control group； B：Diabetes group； C：Treatment group

2.3心肌組織MDA含量、SOD和GSH-Px活性的檢測(cè)

與對(duì)照組相比，糖尿病組MDA含量明顯升高(P<0.01)，SOD和GSH-Px活性明顯下降(P<0.01)；與糖尿病組比較，治療組MDA含量明顯下降(P<0.01)，SOD和GSH-Px活性明顯升高(P<0.05，P<0.01，表2)。

GroupMDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)GSH-Px(U/mgprot)Control12.62±2.33182.31±17.34152.50±17.18Diabetes19.39±2.88**129.72±16.38**114.84±13.86**Treat-ment16.02±2.57##150.71±15.77##130.61±15.11#

MDA: Malondialdehyde; SOD: Superoxide dismutase; GSH-Px: Glutathione peroxidase

**P<0.01vscontrol group；?#P<0.05，##P<0.01vsdiabetes group

2.4心肌組織CHOP、GRP78和Caspase 12 mRNA的表達(dá)

與對(duì)照組比較，糖尿病組CHOP、GRP78和Caspase 12 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與糖尿病組比較，治療組CHOP、GRP78和Caspase 12 mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.01，表3，圖2)。

GroupCHOP/GAPDHGRP78/GAPDHCaspase12/GAPDHControl0.27±0.080.28±0.090.26±0.07Diabetes0.63±0.11**0.71±0.12**0.69±0.14**Treat-ment0.42±0.09##0.57±0.11##0.52±0.13##

CHOP: C/EBP homologous protein; GRP78: Glucose regulated protein 78

**P<0.01vscontrol group；?##P<0.01vsdiabetes group

Fig. 2mRNA levels of CHOP, GRP78 and Caspase 12 in rats

M：Marker； 1：Control group； 2：Diabetes group； 3：Treatment group； CHOP: C/EBP homologous protein; GRP78: Glucose regulated protein 78

3　討論

DCM是由糖尿病引起的心臟微血管病變、心肌代謝紊亂及纖維化等所導(dǎo)致的心肌結(jié)構(gòu)異常，最終引起左心室肥厚、舒張期和(或)收縮期功能障礙的一種疾病。DCM的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括心肌細(xì)胞凋亡增多。目前能引起DCM心肌細(xì)胞凋亡的原因主要包括：高血糖、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝障礙等。STZ可以選擇性破壞動(dòng)物胰島的β細(xì)胞，導(dǎo)致長(zhǎng)期的胰島素缺乏及血糖水平提升。通過(guò)給予大鼠一次性大劑量腹腔注射STZ制備1型糖尿病大鼠模型，糖尿病造模成功后4周，心肌損傷明顯；8周，即為糖尿病心肌病[9]。隨著糖尿病進(jìn)程的持續(xù)發(fā)展，大鼠糖尿病組的左心室功能指標(biāo)明顯降低，心肌纖維排列紊亂，線粒體腫脹，心肌損傷嚴(yán)重。H2S被認(rèn)為是調(diào)節(jié)心血管功能的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子[6]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性H2S對(duì)心肌組織具有保護(hù)作用[7,8,10]，心肌組織中適宜的H2S水平對(duì)維持心肌組織正常結(jié)構(gòu)與功能具有重要調(diào)節(jié)作用。Su等[7]利用在體測(cè)定大鼠心功能的導(dǎo)管法，發(fā)現(xiàn)外源性給予H2S供體能夠明顯改善阿霉素心肌病大鼠的左心室功能。本實(shí)驗(yàn)利用離體心臟Langendorff灌流法也證實(shí)，外源性補(bǔ)充H2S的供體NaHS后，與糖尿病組相比，治療組的左心室功能指標(biāo)明顯改善，LVDP和±dp/dtmax均明顯升高，心肌超微結(jié)構(gòu)損傷明顯好轉(zhuǎn)，提示H2S對(duì)大鼠糖尿病心肌損傷具有保護(hù)作用。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起到重要作用[11]。氧化應(yīng)激是指活性氧(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生過(guò)多后導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷[12]。而高血糖是產(chǎn)生氧化應(yīng)激的主要原因，通過(guò)線粒體電子傳遞鏈途徑增加機(jī)體ROS的含量。ROS是誘導(dǎo)體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激的主要物質(zhì)，包括超氧陰離子、過(guò)氧化氫和羥基自由基等。當(dāng)ROS產(chǎn)生速率超過(guò)其清除速率時(shí)就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激[13]。ROS與多不飽和脂肪酸反應(yīng)的產(chǎn)物是脂質(zhì)過(guò)氧化物，因此MDA的含量可以反映機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的程度。SOD和GSH-Px能夠清除超氧產(chǎn)物，將其轉(zhuǎn)化成氧氣和水，因此是細(xì)胞內(nèi)還原力水平的檢測(cè)指標(biāo)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，在阿霉素心肌病中，H2S可以增強(qiáng)清除氧自由基的能力、減少心肌細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化物含量，從而起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[7]。而在糖尿病心肌病中，H2S對(duì)氧化應(yīng)激的作用尚未完全明了。本實(shí)驗(yàn)建立了糖尿病大鼠心肌病模型，結(jié)果顯示：與正常組比較，糖尿病組心肌細(xì)胞中MDA含量明顯升高，SOD和GSH-Px活性明顯下降，說(shuō)明糖尿病大鼠的心肌存在氧化應(yīng)激損傷。外源性給予H2S后，治療組心肌細(xì)胞MDA含量明顯降低，SOD和GSH-Px活性明顯升高，提示H2S可能通過(guò)提高心肌細(xì)胞中抗氧化酶活性，抑制ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化物生成，減輕氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而保護(hù)糖尿病的心肌組織。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，主要參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成以及合成后折疊等。病理刺激如氧化應(yīng)激，脂質(zhì)積聚等都會(huì)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理功能[14]，引起未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的聚集，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過(guò)激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response， UPR)來(lái)保護(hù)由ERS引起的損傷，如果損傷嚴(yán)重，ERS可以啟動(dòng)凋亡程序，而ERS啟動(dòng)的凋亡是經(jīng)一種新的途徑，不同于以往熟知的死亡受體及線粒體途徑[5]。ER定位分子伴侶GRP78是ERS的經(jīng)典標(biāo)志物，UPR可以上調(diào)GRP78的表達(dá)，有助于修復(fù)蛋白質(zhì)的折疊。但若ERS長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)時(shí)，會(huì)通過(guò)促進(jìn)CHOP的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)[15]， Caspase 12依賴途徑及激活c-Jun氨基末端激酶依賴途徑等啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過(guò)程。我們的研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠的心肌組織中GRP78、CHOP和Caspase 12 mRNA表達(dá)水平明顯增加，提示ERS可能參與了糖尿病大鼠的心肌細(xì)胞凋亡，在糖尿病心肌病的發(fā)展中起重要作用。外源性補(bǔ)充H2S后，與糖尿病組相比，治療組心肌組織中GRP78、CHOP和Caspase 12 mRNA表達(dá)水平明顯下降，提示H2S可能通過(guò)以下3種機(jī)制抑制ERS：(1)下調(diào)GRP78的表達(dá)，抑制CHOP的轉(zhuǎn)錄；(2)抑制Caspase 12的激活，繼而抑制下游的Caspase家族成員的激活，抑制心肌細(xì)胞凋亡；(3)提高抗氧化酶活性，減少ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化物生成，降低未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的積聚，從而抑制ERS。因此，可以得出結(jié)論，H2S可以通過(guò)減輕氧化應(yīng)激損傷和抑制ERS，改善糖尿病大鼠的心功能和心肌超微結(jié)構(gòu)，保護(hù)糖尿病大鼠的心肌組織。

綜上所述，外源性H2S可能是通過(guò)減輕大鼠糖尿病心肌病氧化應(yīng)激損傷，以及抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡途徑，從而起到保護(hù)心肌損傷的作用。

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Effect of hydrogen sulfide on oxidative stress and endoplasmic reticulum stress in diabetic cardiomyopathy

YANG Rui, JIA Qiang, LIU Xiao-fen, GAO Qin, WANG Lei, MA Shan-feng△

(Department of Physiology, Bengbu Medical College, Bengbu 233030, China)

Objective: To investigate the effects of hydrogen sulfide (H2S) on oxidative stress and endoplasmic reticulum stress (ERS) in a rat model of diabetic cardiomyopathy (DCM). Methods: Thirty male SD rats were randomly divided into control group, diabetes group and treatment group(n=10). Intraperitoneal injection of streptozotocin was utilized to establish a rat model of DCM．The rats with DCM in treatment group were intraperitoneally injected with NaHS solution. After treated for 12 weeks, the hearts isolated from rats were perfused on a langendorff apparatus. The ventricular hemodynamic parameters were measured. The ultrastructures of myocardium were observed using electron microscopy. The content of malondialdehyde (MDA), the activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) in myocardial tissue were determined by spectrophotometry. The expressions of C/EBP homologous protein(CHOP), glucose-regulated protein 78 (GRP78) and Caspase 12 at mRNA level in myocardium were detected using RT-PCR. Results: Compared with control group, the cardiac function and myocardial ultrastructure were damaged obviously in diabetic rats. In myocardial tissue, the content of MDA was increased, while the activities of SOD and GSH-Px were decreased. CHOP, GRP78 and Caspase 12 mRNA expressions were increased significantly. Compared with diabetes group, cardiac function and myocardial ultrastructure damage were improved in treatment group. The content of MDA was decreased, while the activities of SOD and GSH-Px were increased significantly. The mRNA levels of CHOP, GRP78 and Caspase 12 were increased. Conclusion: H2S can protect myocardium in diabetic rats, maybe it is related to reduce oxidative stress damage and inhibition of the ERS-induced apoptosis pathway.

hydrogen sulfide；diabetic cardiomyopathy；rat；oxidative stress；endoplasmic reticulum stress

國(guó)家自然科學(xué)基金(81000074)；安徽省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2013B146，KJ2015B006by,KJ2015A163)；蚌埠醫(yī)學(xué)院科研項(xiàng)目(BY0907、BYKY1312)

2015-01-30

2015-06-15

△Tel：0552-3175269； E-mail：msfbio@163.com

R363.2

A

1000-6834(2016)01-008-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.003