楊　銳，劉小粉，馬善峰，高　琴，李正紅，賈　強(qiáng)

(蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030)

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硫化氫對(duì)1型糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用*

楊銳，劉小粉，馬善峰，高琴，李正紅，賈強(qiáng)△

(蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030)

目的：觀察硫化氫(H2S)對(duì)1型糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法：32只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照(NC)組、糖尿病(DM)組、糖尿病治療(NaHS+DM)組和NaHS對(duì)照(NaHS)組(n=8)。DM組和NaHS+DM組大鼠采用鏈脲佐菌素(STZ)55 mg/kg腹腔注射誘導(dǎo)1型糖尿病模型。造模成功后，NaHS+DM組和NaHS組采用腹腔注射N(xiāo)aHS溶液56 μmol/kg干預(yù)治療。8周后，測(cè)定大鼠24 h尿蛋白含量、腎重指數(shù)、空腹血糖、尿素氮、肌酐等指標(biāo)；HE染色觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)變化；測(cè)定腎臟組織脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和Caspase-3的活性；Western blot檢測(cè)腎臟組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果：與NC組相比，NaHS組各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著差異，DM組，24 h尿蛋白含量、腎重指數(shù)、空腹血糖、尿素氮和肌酐水平均明顯升高；HE染色結(jié)果顯示腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)增多；MDA含量、Caspase-3活性和Bax蛋白表達(dá)明顯增高；SOD活性和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低。與DM組相比，NaHS+DM組腎功能損傷明顯減輕，腎臟組織形態(tài)學(xué)變化明顯改善，MDA含量、Caspase-3活性和Bax蛋白表達(dá)明顯下降，SOD活性和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增高。結(jié)論：H2S對(duì)1型糖尿病大鼠腎臟具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡有關(guān)。

硫化氫；糖尿?。淮笫?；腎功能；氧化應(yīng)激；細(xì)胞凋亡；

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，由糖尿病微血管病變引起，以腎小球硬化為主要病理特征。但是DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今仍未完全明確。目前認(rèn)為，糖基化終末產(chǎn)物、炎癥細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等都參與了糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展，導(dǎo)致腎臟細(xì)胞外基質(zhì)的增生，腎小球基底膜增厚，最終形成糖尿病腎病[1-2]。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是繼NO和CO之后新發(fā)現(xiàn)的第3種新型氣體信號(hào)分子，參與機(jī)體內(nèi)許多生理功能的調(diào)控[3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)外源性補(bǔ)充H2S的供體硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS),可以明顯減輕1型糖尿病大鼠心肌組織損傷，抑制心肌組織氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡[4]。然而，外源性H2S對(duì)1型糖尿病大鼠腎臟是否具有抗細(xì)胞凋亡作用，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)給予大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(steptozotocin，STZ)建立1型糖尿病腎臟損傷的動(dòng)物模型，通過(guò)外源性給予NaHS(56 μmol/kg)作為H2S的供體，研究外源性H2S對(duì)糖尿病大鼠腎功能相關(guān)指標(biāo)、腎臟形態(tài)學(xué)變化、以及氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)和活性的影響，探討外源性H2S對(duì)1型糖尿病大鼠腎臟損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器

STZ和NaHS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗大鼠β-actin一抗抗體購(gòu)自proteintech公司；兔抗大鼠Bcl-2和Bax一抗抗體購(gòu)自博士德生物科技有限公司，山羊抗兔二抗抗體購(gòu)自biosharp生物技術(shù)有限公司。大鼠代謝籠購(gòu)自南京便診生物科技有限公司，電泳儀、電轉(zhuǎn)槽和ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2動(dòng)物分組及處理

雄性SD大鼠32只(蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重160～200 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對(duì)照(normal control,NC)組，糖尿病(diabetes mellitus,DM)組，糖尿病治療(DM treatment,NaHS+DM)組和NaHS對(duì)照(NaHS control,NaHS)組(n=8)。DM組和NaHS+DM組大鼠空腹12 h后，一次性腹腔注射STZ 55 mg/kg，72 h后尾靜脈采血測(cè)空腹血糖值，取血糖值≥16.7 mmol/L為糖尿病模型。造模成功后，NaHS+DM組和NaHS組開(kāi)始腹腔注射N(xiāo)aHS溶液56 μmol/kg(NaHS作為外源性H2S供體，現(xiàn)用現(xiàn)配，濃度為20 mmol/L)，NC組和DM組腹腔注射生理鹽水2.8 ml/kg，每天1次，共持續(xù)8周。第8周末，大鼠處死前2 d用代謝籠收集24 h尿液，記錄尿量，測(cè)定24 h尿蛋白總量。

1.3空腹血糖、血清尿素氮和肌酐檢測(cè)

第8周末，測(cè)大鼠空腹體重，用10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉，腹主動(dòng)脈采血，離心后取血清用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)空腹血糖(fasting blood gulcose，F(xiàn)BG)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血肌酐(serum creatinine，Scr)水平。

1.4HE染色觀察腎臟形態(tài)學(xué)變化

大鼠處死后，速取兩側(cè)腎臟，去除包膜，稱(chēng)重，計(jì)算腎重指數(shù)(雙側(cè)腎重/體重，renal index)。左腎分裝后置于-80℃冰箱保存；右腎置10%甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察腎臟形態(tài)學(xué)變化。

1.5生化指標(biāo)檢測(cè)

取腎臟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別測(cè)定MDA含量、SOD和Caspase-3活性。

1.6Western blot檢測(cè)Bcl-2和Bax 蛋白表達(dá)

取腎臟組織50 mg，加細(xì)胞裂解液勻漿，離心后取上清，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。各組取30 μg上樣，SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%TBST脫脂奶粉室溫封閉2 h后，分別加入一抗1∶400稀釋的Bcl-2和Bax多克隆抗體，1∶1 000稀釋的β-actin單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜。次日，二抗孵育1 h，濃度為1∶1 000?；瘜W(xué)發(fā)光ECL顯色，曝光成像。凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定條帶的灰度值，計(jì)算Bcl-2/β-actin和Bax/β-actin蛋白表達(dá)的相對(duì)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1各組大鼠FBG、BUN和Scr水平比較

與NC組相比，DM組和NaHS+DM組大鼠FBG、BUN和Scr水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)；與DM組相比，NaHS+DM組FBG、BUN和Scr水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)；NaHS組與NC組比較無(wú)顯著差異(表1)。

2.2各組大鼠24 h尿蛋白、體重、腎重和腎重指數(shù)比較

與NC組相比，DM組和NaHS+DM組大鼠體重明顯減輕(P<0.01)，24 h尿蛋白、雙側(cè)腎重和腎重指數(shù)明顯升高(P<0.05，P<0.01)；與DM組相比，NaHS+DM組大鼠體重明顯增加(P<0.01)，24 h尿蛋白、雙側(cè)腎重和腎重指數(shù)明顯降低(P<0.05，P<0.01)；NaHS組與NC組比較無(wú)顯著差異(表2)。

Tab.

NC:Normal control;DM:Diabetes mellitus;NaHS+DM:DM treatment;NaHS:NaHS control;FBG:Fasting blood glucose;BUN:Blood urea nitrogen;Scr:Serum creatinine

*P<0.05,**P<0.01 vs NC group;#P<0.05,##P<0.01 vs DM group

2.3各組大鼠腎臟形態(tài)學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示:NC組腎小球結(jié)構(gòu)正常；DM組較NC組腎小球基底膜增厚，系膜基質(zhì)增多；而NaHS+DM組腎小球形態(tài)基本正常，病理形態(tài)學(xué)改變明顯輕于DM組；NaHS組與NC組比較無(wú)明顯差異(圖1見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅱ)。

2.4腎臟組織MDA含量、SOD和Caspase-3活性的檢測(cè)

與NC組相比，DM組SOD活性明顯下降(P<0.01)，MDA含量和Caspase-3活性明顯升高(P<0.01)；與DM組比較，NaHS+DM組SOD活性明顯升高(P<0.01)，MDA含量和Caspase-3活性明顯下降(P<0.01)；NaHS組與NC組比較無(wú)顯著差異(表3)。

Tab.2　Levels of 24 h urinary protein,body weight,kidney weight and renal ±s，n=8)

NC:Normal control;DM:Diabetes mellitus;NaHS+DM:DM treatment;NaHS:NaHS control

*P<0.05,**P<0.01 vs NC group;#P<0.05,##P<0.01 vs DM group

GroupMDA(nmol/mg)SOD(U/mg)Caspase-3(U/mg)NC4.03±0.5891.72±17.760.37±0.09DM7.17±1.21**54.12±11.32**0.79±0.15**NaHS+DM5.49±0.94##75.49±12.91##0.56±0.11##NaHS4.14±0.6794.78±18.430.40±0.10

NC:Normal control;DM:Diabetes mellitus;NaHS+DM:DM treatment;NaHS:NaHS control;MDA:Malondialdehyde;SOD:Superoxide dismutase

**P<0.01 vs NC group;##P<0.01 vs DM group

2.5腎臟組織Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)

與NC組比較，DM組Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，Bax蛋白表達(dá)增高(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值下降(P<0.01)。與DM組比較，NaHS+DM組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)，Bax蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值增高(P<0.01，圖2，表4)。

Fig.2Protein expression levels of Bcl-2 and Bax in renal tissue

GroupBcl-2/β-actinBax/β-actinBcl-2/BaxNC0.38±0.090.27±0.061.08±0.22DM0.14±0.06**0.48±0.09**0.28±0.11**NaHS+DM0.27±0.07##0.36±0.08##0.75±0.19##NaHS0.40±0.100.28±0.050.98±0.24

NC:Normal control;DM:Diabetes mellitus;NaHS+DM:DM treatment;NaHS:NaHS control

**P<0.01 vs NC group;##P<0.01 vs DM group

3　討論

糖尿病腎病(DN)是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致慢性腎功能衰竭的主要原因。其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為人類(lèi)健康的重要威脅。DN基本病理改變?yōu)槟I小球系膜區(qū)基質(zhì)增多、基底膜增厚，臨床表現(xiàn)為持續(xù)的尿蛋白排泄增加[5]。本實(shí)驗(yàn)采用一次性大劑量腹腔注射STZ復(fù)制1型糖尿病大鼠模型，觀察腎功能指標(biāo)和形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，造模成功8周后，與NC組比較，DM組大鼠體重明顯下降，F(xiàn)BG、BUN、Scr、24 h尿蛋白量、雙側(cè)腎重和腎重指數(shù)均顯著升高。HE染色結(jié)果顯示腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)增多，表明DN模型復(fù)制成功。

H2S是一種具有臭雞蛋氣味的有毒氣體，以往人們一直關(guān)注其對(duì)機(jī)體的毒性作用，直到20世紀(jì)90年代中期，H2S被證實(shí)是第3種新型氣體信號(hào)分子[6]。在機(jī)體內(nèi)，內(nèi)源性H2S是由半胱氨酸磷酸吡多醛-5’-磷酸-依賴(lài)性酶包括胱硫醚-β-合成酶(cystathionine -β- synthase,CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)及半胱氨酸轉(zhuǎn)移酶催化作用下產(chǎn)生的[4]。研究發(fā)現(xiàn)，在人類(lèi)和其他許多哺乳動(dòng)物的腎臟中均有CSE和CBS的表達(dá)，內(nèi)源性H2S的增多有效抑制了DN的病理改變[7]。Zhou等[8]研究結(jié)果顯示，外源性給予糖尿病大鼠NaHS 14 μmol/kg后能夠改善腎功能指標(biāo)和病理結(jié)構(gòu)損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，通過(guò)外源性給予大鼠補(bǔ)充H2S的供體NaHS 56 μmol/kg后，NaHS組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)與NC組無(wú)顯著差異；而與DM組相比，NaHS+DM組大鼠體重明顯增加，F(xiàn)BG、BUN、Scr、24 h尿蛋白量、腎重和腎重指數(shù)均明顯降低，形態(tài)學(xué)損傷明顯改善，結(jié)果顯示外源性補(bǔ)充H2S對(duì)糖尿病大鼠腎臟具有保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激在DN的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[9]。DN時(shí)氧化和抗氧化系統(tǒng)的失衡及氧自由基產(chǎn)生過(guò)多是腎組織病變的主要發(fā)病機(jī)制之一?；钚匝?reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生是氧化應(yīng)激的基本環(huán)節(jié)，當(dāng)ROS生成過(guò)多時(shí)，會(huì)破壞組織蛋白，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物，進(jìn)一步擴(kuò)大氧化損傷[10]。機(jī)體中MDA的含量反映氧化應(yīng)激損傷的程度，SOD可以清除超氧產(chǎn)物，是細(xì)胞內(nèi)還原力水平的檢測(cè)指標(biāo)。研究表明，在阿霉素誘導(dǎo)的心肌病中，外源性H2S可以清除氧自由基、降低脂質(zhì)過(guò)氧化物含量，對(duì)心臟具有保護(hù)作用[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組比較，DM組MDA含量明顯升高，SOD活性明顯下降，說(shuō)明糖尿病大鼠的腎臟存在氧化應(yīng)激損傷。外源性補(bǔ)充H2S后，NaHS+DM組MDA含量明顯降低，SOD活性明顯升高，提示H2S可能通過(guò)提高SOD活性，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA的生成，減輕糖尿病大鼠腎臟的氧化應(yīng)激損傷。

細(xì)胞凋亡在DN的發(fā)展中起一定作用，而B(niǎo)cl-2家族蛋白如Bcl-2、Bax等在細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)過(guò)程中均起重要作用。Bcl-2和Bax可以形成異源二聚體，抑制細(xì)胞色素C的釋放，繼而抑制下游Caspase-3的激活，有效抑制細(xì)胞凋亡[12]，當(dāng)Bcl-2和Bax的比值增高時(shí)，提示抑制細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)。Caspase-3在Caspase家族中處于關(guān)鍵位置，因此Caspase-3常作為凋亡發(fā)生的標(biāo)志酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組比較，DM組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降，Bax表達(dá)明顯升高，Caspase-3活性增高，提示糖尿病大鼠腎臟中存在細(xì)胞凋亡。外源性補(bǔ)充H2S后，NaHS+DM組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高，Bax蛋白表達(dá)明顯下降，Caspase-3活性明顯下降，提示H2S可以通過(guò)上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，繼而抑制下游Caspase-3活性，起到抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)腎臟組織的作用。

因此，我們得出結(jié)論，糖尿病大鼠腎臟組織存在氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡，外源性補(bǔ)充H2S能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，改善糖尿病大鼠的腎臟損傷，進(jìn)而保護(hù)糖尿病大鼠的腎臟組織。

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Protective effect of hydrogen sulfide on kidneys of type 1 diabetic rats

YANG Rui,LIU Xiao-fen,MA Shan-feng,GAO Qin,LI Zheng-hong,JIA Qiang△

(Department of Physiology,Bengbu Medical College,Bengbu 233030,China)

Objective:To explore the protective effects of hydrogen sulfide(H2S)on kidneys of type 1 diabetic rats and its underlying mechanism.Methods:Thirty-two male SD rats were randomly divided into four groups：normal control(NC)group,diabetes mellitus(DM)group,DM treatment(NaHS+DM)group and NaHS control(NaHS)group.The rats from DM group and NaHS+DM group were injected intraperitoneally with Streptozotocin 55 mg/kg to induce type 1 diabetes mellitus(n=8).After modeling,rats in NaHS+DM group and NaHS group were intraperitoneally injected with NaHS solution at the dosage of 56 μmol/kg.After 8 weeks,urinary protein content was detected in urine samples collected for 24 h.and the ratio of kidney weight/body weight(renal index)was determined in isolated kidneys.Besides,the levels of fasting blood glucose(FBG),blood urea nitrogen(BUN)and serum creatinine(Scr)were measured biochemically.The morphological changes of renal tissue were observed by HE staining.The content of malondialdehyde(MDA),the activities of superoxide dismutase(SOD)and Caspase-3 in renal tissue were determined by spectrophotometry.The protein expression levels of Bcl-2 and Bax in renal tissue were detected using Western blot.Results:There was no significant difference in the respective measured indexes in rats between NC group and NaHS group.However,in DM group,the levels of 24 h urinary protein,FBG,BUN,Scr and renal index were increased significantly;HE staining showed that the basement membrane was thickened and the amount of glomerular mesangial matrix was increased;MDA content,Caspase-3 activity and Bax expression levels were increased,while SOD activity and Bcl-2 expression were decreased.Compared with those in DM group,the morphological changes of renal tissue and its function were improved;MDA content,Caspase-3 activity and Bax expression were decreased significantly,while SOD activity and Bcl-2 expression were increased obviously in NaHS+DM group.Conclusion:H2S can protect the kidneys of type 1 diabetic rats,which is related to suppressing oxidative stress and cell apoptosis.

hydrogen sulfide;diabetes mellitus;rat;renal function;oxidative stress;cell apoptosis

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81000074)；安徽省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2013B146，KJ2015B006by，KJ2015A163)；蚌埠醫(yī)學(xué)院科研項(xiàng)目(BYKY1312,BYKY1414ZD)

2015-08-13

2016-01-26

△Tel：0552-3175269；E-mail：jiaqiangbbmc@sina.com

R587.1

A

1000-6834(2016)02-181-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.023