朱翔翡，陸曉媛，王靜

(1徐州醫(yī)學院研究生學院，江蘇徐州221002；2徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

?

子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織中Twist蛋白、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白表達變化

朱翔翡1，陸曉媛2，王靜2

(1徐州醫(yī)學院研究生學院，江蘇徐州221002；2徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

目的觀察子宮內(nèi)膜異位癥患者異位子宮內(nèi)膜組織中Twist蛋白、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)及N-鈣黏蛋白(N-cadherin)的表達變化，探討三者與子宮內(nèi)膜異位癥的關系。方法采用免疫組化SP法檢測30例子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜組織(在位內(nèi)膜組)、異位內(nèi)膜組織(異位內(nèi)膜組)及30例非子宮內(nèi)膜異位癥患者的正常內(nèi)膜組織(正常對照組)中的Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin，計算各組蛋白高表達(強陽性表達)率；分析異位內(nèi)膜組織中Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin表達的相關性。結(jié)果異位內(nèi)膜組、在位內(nèi)膜組、正常對照組中Twist蛋白高表達率分別為70.0%、30.0%、6.7%，E-cadherin高表達率分別為6.7%、23.3%、73.3%，N-cadherin高表達率分別為66.7%、30.0%、3.3%，Twist蛋白及N-cadherin高表達率在異位內(nèi)膜組、在位內(nèi)膜組、正常對照組依次升高，E-cadherin高表達率依次減小(P均<0.05)。異位內(nèi)膜組織中Twist蛋白表達與E-cadherin表達呈負相關關系(r=-0.463，P<0.01)，與N-cadherin表達呈正相關關系(r=0.616，P<0.01)；E-cadherin表達與N-cadherin表達呈負相關關系(r=-0.502，P<0.01)。結(jié)論子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位子宮內(nèi)膜組織中Twist蛋白和N-cadherin表達上調(diào)，E-cadherin表達下調(diào)，三者相互作用，共同參與了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。

子宮內(nèi)膜異位癥；異位子宮內(nèi)膜;Twist蛋白；E-鈣黏蛋白；N-鈣黏蛋白；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是婦科常見病、多發(fā)病，也是具有轉(zhuǎn)移及復發(fā)特點的良性疾病，其發(fā)病原因目前尚不明確。近年來研究者[1]提出“在位內(nèi)膜決定論”，即異位子宮內(nèi)膜的種植、生長與子宮內(nèi)膜的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等能力密不可分。子宮內(nèi)膜的轉(zhuǎn)移能力可能與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)有關[2，3]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子Twist基因、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)及N-鈣黏蛋白(N-cadherin)是EMT過程中的重要因子[4，5]，在乳腺癌、膀胱癌等惡性疾病中研究較多，但對于三者在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達少有報道。為此，本研究觀察了子宮內(nèi)膜異位癥患者異位子宮內(nèi)膜組織中Twist蛋白、E-cadherin及N-cadherin的表達變化，分析三者與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展的關系?，F(xiàn)報告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2013年9月～2015年7月在徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院行腹腔鏡下盆腔子宮內(nèi)膜異位病灶清除術的子宮內(nèi)膜異位癥患者30例，年齡24～52歲，術中留取異位內(nèi)膜組織(異位內(nèi)膜組)和在位內(nèi)膜組織(在位內(nèi)膜組)各30例份。隨機選取行診斷性刮宮治療的非子宮內(nèi)膜異位癥患者30例，年齡28～51歲，術中留取正常增生期子宮內(nèi)膜組織30例份(正常對照組)。納入研究的所有患者均未合并其他子宮內(nèi)膜病變，術前6個月內(nèi)未行性激素類藥物或其他藥物治療，未放置宮內(nèi)節(jié)育器，無妊娠及哺乳、刮宮史，無內(nèi)分泌疾病及免疫疾病。子宮內(nèi)膜異位癥患者與非子宮內(nèi)膜異位癥患者的年齡、孕次和月經(jīng)周期資料具有可比性。見表1。

表1　納入患者年齡、孕次、月經(jīng)周期比較±s)

1.2主要試劑及儀器兔抗人多克隆抗體Twist購自北京博奧森生物技術有限公司，兔抗人多克隆抗體E-cadherin購自美國Proteintech Group公司(由徐州博立達生物科技有限公司代購)，兔抗人多克隆抗體N-cadherin購自美國Proteintech Group公司(由徐州博立達生物科技有限公司代購)，SP免疫組化試劑盒及DAB顯色劑均購自徐州博立達生物科技有限公司。

1.3Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin檢測采用免疫組化SP法。具體步驟如下：石蠟常規(guī)包埋組織，4 μm連續(xù)切片；切片脫蠟，水化；高壓修復5 min(出蒸汽后計算)，使用枸櫞酸修復液；3%過氧化氫封閉30 min；PBS清洗后滴加一抗，4 ℃過夜；滴加生物素標記的二抗，室溫30 min；滴加SP，室溫30 min；DAB顯色；蘇木精復染。首先在低倍鏡下閱片，再在高倍鏡下選取5個視野進行計數(shù)，計數(shù)不少于100個細胞，以細胞中出現(xiàn)棕褐色、棕黃色或淡黃色顆粒為蛋白表達陽性[6，7]；Twist、N-cadherin主要定位于細胞質(zhì)，細胞膜也有少量表達；E-cadherin主要定位于細胞膜，少數(shù)在細胞質(zhì)有表達。根據(jù)染色強度與陽性細胞百分比判定結(jié)果：染色強度為無色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；陽性細胞百分比≤5%計0分，>5%～25%計1分，>25%～50%計2分，>50%計3分；兩項積分相加，0、1分為陰性(-)，2分為弱陽性(+)，3、4分為陽性(++)，5、6分為強陽性(+++)，統(tǒng)計強陽性表達(高表達)例數(shù)。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1各組子宮內(nèi)膜組織中Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin表達比較異位內(nèi)膜組、在位內(nèi)膜組、正常對照組中Twist蛋白高表達率分別為70.0%、30.0%、6.7%，E-cadherin高表達率分別為6.7%、23.3%、73.3%，N-cadherin高表達率分別為66.7%、30.0%、3.3%，Twist蛋白及N-cadherin高表達率在異位內(nèi)膜組、在位內(nèi)膜組、正常對照組依次升高，E-cadherin高表達率依次減小(P均<0.05)。詳見表2。

表2　不同子宮內(nèi)膜組織中Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin表達比較

注：與正常對照組相比，*P<0.05；與在位內(nèi)膜組相比，#P<0.05。

2.2異位內(nèi)膜組織中Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin表達相關性分析異位內(nèi)膜組織中Twist蛋白表達與E-cadherin表達呈負相關關系(r=-0.463，P<0.01)，與N-cadherin表達呈正相關關系(r=0.616，P<0.01)；E-cadherin表達與N-cadherin表達呈負相關關系(r=-0.502，P<0.01)。

3　討論

EMT存在于在胚胎發(fā)育、組織重建、慢性炎癥等過程中，EMT伴隨上皮細胞極性消失、細胞骨架重塑、細胞間黏附力減弱及細胞遷移能力增強[8，9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移及多種纖維化疾病的發(fā)病有關。鈣黏蛋白在EMT過程中發(fā)揮重要作用。上皮細胞間連接需要E-cadherin，其高表達可抑制細胞遷移，使細胞保持完整、緊密連接，并完成機體相關指令；而在多種因素影響下，如腫瘤基因突變、基因異常轉(zhuǎn)錄后修飾(磷酸化或糖基化)、蛋白水解增強等均可導致E-cadherin表達下調(diào)或缺失，減弱細胞黏附能力，細胞極性發(fā)生改變、運動能力增強，容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。多數(shù)腫瘤組織中E-cadherin表達受抑，導致細胞表型改變，間充質(zhì)細胞中N-cadherin表達增高，腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強[11，12]，因此，E-cadherin表達降低提示EMT的發(fā)生[13]。本研究中，異位內(nèi)膜組E-cadherin高表達率低于在位內(nèi)膜組和正常對照組，而N-cadherin表達趨勢與之相反，印證了子宮內(nèi)膜異位癥的轉(zhuǎn)移及侵襲性與EMT有關。

Twist基因是參與EMT過程的一種凋亡抑制因子，多項研究顯示其能夠獨立抑制E-cadherin表達同時上調(diào)纖連蛋白和N-cadherin表達。人Twist蛋白通過分子中的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)可特異性結(jié)合DNA上的E-box序列(CANNTG)[14]形成同源或異源二聚體，調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄。國內(nèi)外研究[15，16]表明，Twist作為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，與惡性腫瘤細胞的原位侵襲和遠處轉(zhuǎn)移均有密切關系。

本研究中，E-cadherin在正常對照組、在位內(nèi)膜組、異位內(nèi)膜組表達依次降低，N-cadherin表達依次增高，且E-cadherin與N-cadherin表達呈負相關關系、提示E-cadherin表達降低、N-cadherin表達上調(diào)是EMT發(fā)生的標志，子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展過程中伴隨著EMT。而Twist蛋白在異位內(nèi)膜組織中高表達，且Twist蛋白與E-cadherin表達呈負相關關系、與N-cadherin表達呈正相關關系，同樣說明Twist蛋白表達上調(diào)與EMT關系密切。推測Twist蛋白過度表達抑制了E-cadherin的正常表達，細胞極性減弱，N-cadherin表達上調(diào)，最終導致細胞遷移能力增強。Twist蛋白可能通過誘發(fā)EMT從而促進子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，Twist蛋白高表達、E-cadherin低表達、N-cadherin高表達使得患者子宮內(nèi)膜細胞容易從原位脫離，侵襲力增強。Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin在異位子宮內(nèi)膜組織中的表達變化印證了EMT貫穿子宮內(nèi)膜異位癥的各個環(huán)節(jié)?；谏鲜鰧嶒灲Y(jié)果，我們設想Twist、E-cadherin、N-cadherin有望成為子宮內(nèi)膜異位癥早期診斷的標志物及基因治療的靶點，聯(lián)合檢測三種蛋白有望為子宮內(nèi)膜異位癥的預防、治療、預后評估提供參考。

[1] 郎景和.以轉(zhuǎn)化醫(yī)學的觀念促進子宮內(nèi)膜異位癥的研究[J].國際婦產(chǎn)科雜志,2011,38(4):261-262.

[2] Matsuzaki S,Darcha C.Epithelial to mesenchymal transition-like and mesenchymal to epithelial transition-like processes might be involved in the pathogenesis of pelvic endometriosis[J].Hum Reprod,2012,27(3):712-721.

[3] Bartley J,Jülicher A,Hotz B,et al.Epithelial to mesenchymal transition (EMT) seems to be regulated differently in endometriosis?and the endometrium[J].Arch Gynecol Obstet,2014,289(4):871-881.

[4] Xue G,Hemmings BA.Phosphorylation of basic helix-loop-helix transcription factor Twist in development and disease[J].Biochem Soc Trans,2012,40(1):90-93.

[5] Lander R,Nordin K,LaBonne C.The F-box protein Ppa is a common regulator of core EMT factors Twist,Snail,Slug,and Sip1[J].J Cell Biol,2011,194(1):17-25.

[6] 趙建珍,詹宏,馬俊彥,等.Twist和E-cadherin在卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥中的表達及其意義[J].浙江預防醫(yī)學,2015,27(02):137-141.

[7] Khan KN,Kitajima M,Hiraki K,et al.Immunopathogenesis of pelvic endometriosis:role of hepatocyte gnncth factor,macrophages and ovarian steroids[J].Am J Reprod Immunol,2008,60(5):383-404.

[8] Tania M,Khan MA,Fu J.Epithelial to mesenchymal transition inducing transcription factors and metastatic cancer[J].Tumour Biol,2014,35(10):9523-9530.

[9] Yang G,Yuan J,Li K.EMT transcription factors: implication in osteosarcoma[J].Med Oncol,2013,30(4):697.

[10] Wu Y,Starzinski-Powitz A,Guo SW.Trichestatin A,a histone deacetylase inhibitor,attenuates invasiveness and reactivates E-cadherin expression in immortalized endometriotic cells[J]．Reprod Sci,2007,14(4):374-382.

[11] Garg M.Epithelial-mesenchymal transition-activating transcription factors-multifunctional regulators in cancer[J].World J Stem Cells,2013,5(4):188-195.

[12] Groen RW,de Rooij MF,Kocemba KA,et al.N-Cadherin-mediated interaction with multiple myeloma cells inhibits osteoblast differentiation[J].Haematologica,2011,96(11):1653-1661.

[13] Chen YI,Li HY,Huang CH,et al.Oestrogen-induced epithelial-mesenchymal-transition of endometrial epithelial cells contributes to the development of adenomyosis[J].J Pathol,2010,222(3):261-270.

[14] 趙金朋,何濤.Twist與腫瘤關系研究進展[J].瀘州醫(yī)學院學報,2012,35(4):445-447.

[15] Fondrevelle ME,Kantelip B,Reiter RE,et al.The expression of Twist has an impact on survival in human bladder cancer and is influenced by the smoking status[J]． Urol Oncol,2009,27(3):268-276.

[16] Hennessy BT,Gonzalez-Angulo AM,Stemke-Hale K,et al.Characterization of a naturally occurring breast cancer subset enriched in epithelial-to-mesenchymal transition and stem cell characteristics[J].Cancer Res,2009,69(10):4116-4124.

陸曉媛(E-mail: 378158854@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.022

R711.71

B

1002-266X(2016)19-0062-03

2015-12-08)