劉燕青，吳曉梅，余韜，黎鱗華

(1云南省第一人民醫(yī)院，昆明650000；2昆明醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院)

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四種宮頸脫落細胞HPV DNA檢測方法在高度宮頸病變篩查中的應用對比觀察

劉燕青1，吳曉梅1，余韜1，黎鱗華2

(1云南省第一人民醫(yī)院，昆明650000；2昆明醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院)

目的評價并比較PCR反向雜交技術(shù)、Ⅱ代雜交捕獲技術(shù)(HC-Ⅱ)、實時熒光定量PCR(real-time PCR)8型(real-time PCR-8)和real-time PCR 13型(real-time PCR-13)技術(shù)檢測宮頸脫落細胞人乳頭瘤病毒(HPV) DNA對高度宮頸病變[宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅱ及以上]的篩查效能。方法宮頸薄層液基細胞學檢測(TCT)報告異常的患者436例，采集患者宮頸脫落細胞，分別采用PCR反向雜交技術(shù)、HC-Ⅱ、real-time PCR-8、real-time PCR-13技術(shù)檢測HPV DNA，以病理診斷為金標準，比較四種方法的篩查效能。結(jié)果PCR反向雜交法、HC-Ⅱ、real-time PCR-8、real-time PCR-13檢查對HPV DNA陽性檢出率分別為70.0%、73.2%、70.9%、75.5%，四種方法HPV DNA檢出率相比，P均>0.05。4種HPV DNA檢測方法在宮頸慢性炎癥、CINⅠ、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ、宮頸鱗狀細胞癌(CSCC)患者中的HPV DNA陽性檢出率差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。四種HPV DNA檢測方法對高度宮頸病變篩查的敏感度、特異度、陽性預測值和約登指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。所有標本共發(fā)現(xiàn)18種HPV基因型，其中302例檢出高危型HPV。檢出高危型HPV多重感染100例，其中四重感染2例、三重感染6例、二重感染92例；高低危型HPV多重感染52例。結(jié)論采用real-time PCR-8、real-time PCR-13、PCR反向雜交法及HC-Ⅱ法檢測宮頸脫落細胞HPV DNA對高度宮頸病變的篩查效能相近。

宮頸上皮內(nèi)瘤變；宮頸癌前病變；宮頸癌；人乳頭瘤病毒；Ⅱ代雜交捕獲技術(shù)；聚合酶鏈反應

宮頸癌臨床發(fā)病率、病死率均較高，早期診斷及干預尤為重要。人乳頭瘤病毒(HPV)感染與宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的發(fā)生及進展密切相關(guān)[1]。高危型HPV檢測是目前臨床初步篩查宮頸癌的重要方式。Ⅱ代雜交捕獲技術(shù)(HC-Ⅱ)應用于宮頸癌篩查中有較高的特異度及靈敏度，其他HPV DNA檢測方法常以HC-Ⅱ檢測結(jié)果作為標準對照[2～4]，但HC-Ⅱ無法對HPV分型，而HPV分型對于宮頸病變程度評估及HPV流行情況分析等意義重大。目前HPV分型檢測均以PCR為基礎，敏感性較高，臨床上應用日益廣泛。由于PCR操作過程中易因污染導致假陽性，難以在不同實驗室建立統(tǒng)一的標準，許多基于PCR的檢測方法的實用性、準確性尚不明確?；赑CR的HPV DNA檢測相關(guān)研究報道較多[5～7]，但較少對不同PCR方法的篩查價值進行比較。為此，本研究評價并比較了PCR反向雜交技術(shù)、HC-Ⅱ、實時熒光定量PCR(real-time PCR)8型(real-time PCR-8)和real-time PCR 13型(real-time PCR-13)技術(shù)檢測宮頸脫落細胞HPV DNA對高度宮頸病變(CINⅡ及以上)的篩查效能，現(xiàn)報告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料2013年12月～2015年4月進行宮頸癌前病變篩查且宮頸薄層液基細胞學檢測(TCT)報告異常的患者436例，年齡21～66(38±12)歲。

1.2宮頸脫落細胞中HPV DNA檢測每例患者收集宮頸脫落細胞(移形帶處)標本2份，采樣在非月經(jīng)期進行，采樣前1 d無性生活，3 d內(nèi)未使用陰道栓劑。將宮頸脫落細胞保存于細胞存儲液中，3 d內(nèi)分別采用PCR反向雜交技術(shù)、HC-Ⅱ、real-time PCR-8、real-time PCR-13檢測HPV DNA。收集四種方法對HPV DNA的檢測結(jié)果，以病理檢查結(jié)果為金標準[包括宮頸慢性炎癥、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸鱗狀細胞癌(CSCC)]，計算并比較4種檢測方法篩查高度宮頸病變的靈敏度、特異度、陽性及陰性預測值、約登指數(shù)。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

PCR反向雜交法、HC-Ⅱ、real-time PCR-8、real-time PCR-13檢查對高危HPV DNA陽性檢出率分別為70.0%、73.2%、70.9%、75.5%，四種方法HPV DNA檢出率相比，P均>0.05。436例患者中，病理診斷為宮頸慢性炎癥174例、CSCC 14例、CINⅠ122例、CINⅡ68例、CINⅢ58例。4種HPV DNA檢測方法對宮頸慢性炎癥、CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ、CSCC患者宮頸脫落細胞HPV DNA的陽性檢出率差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。詳見表1。四種HPV DNA檢測方法對高度宮頸病變篩查的敏感度、特異度、陽性預測值和約登指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。詳見表2。

表1　四種HPV DNA檢測方法對不同宮頸病變患者宮頸脫落細胞HPV DNA的陽性檢出率比較(%)

表2　四種HPV DNA檢測方法對高度宮頸病變篩查的敏感度、特異度、陽性預測值和約登指數(shù)比較(%)

本次檢測中共發(fā)現(xiàn)18種HPV基因型，其中302例檢出高危型HPV，其中HPV68 5例、HPV59 6例、HPV582 2例、HPV56 10例、HPV521 20例、HPV5 15例、HPV4 52例、HPV39 18例、HPV35 5例、HPV33 35例、HPV31 14例、HPV18 18例、HPV16 42例，共13種。檢出高危型HPV多重感染100例，其中四重感染2例、三重感染6例、二重感染92例；高低危型HPV多重感染52例。

3　討論

多項研究[8～10]表明，高危型HPV長期感染為宮頸癌發(fā)生和進展的必要條件，高危HPV篩查對早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌變意義重大。PCR和HC-Ⅱ技術(shù)是目前應用最廣的HPV DNA檢測技術(shù)[11]。HC-Ⅱ是惟一得到FDA認證的HPV DNA檢測技術(shù)。HC-Ⅱ法可檢測包括5種低危型HPV和13種高危型HPV，檢測過程高度標準和自動化，具有良好的可重復性，實驗結(jié)果不受地理和人為條件限制，具有定量設計及高效等優(yōu)點[12]?；赑CR的多種HPV DNA檢測技術(shù)可同時開展多種病毒亞型的高通量測定，為當前HPV DNA檢測和分型敏感度最佳的技術(shù)[13]。但由于各個實驗室開發(fā)的基于PCR的檢測方法尚未形成統(tǒng)一標準，且PCR操作過程中易受污染而出現(xiàn)假陽性，故其在宮頸病變篩查中的應用價值仍待深入研究[14]。

我們同時采用HC-Ⅱ、real-time PCR-8、real-time PCR-13、PCR反向雜交法對宮頸TCT報告異常的受檢者行宮頸脫落細胞HPV DNA檢測，綜合評價了4種方法對高度宮頸病變的篩查效能。本研究結(jié)果顯示，real-time PCR-8、real-time PCR-13、PCR反向雜交法及HC-Ⅱ法HPV DNA陽性檢出率差異無統(tǒng)計學意義，表明基于PCR的HPV DNA檢測已具有較為穩(wěn)定的效能。4種方法篩查高度宮頸病變的特異度、靈敏度等指標差異均無統(tǒng)計學意義，提示PCR反向雜交法、real-time PCR-8、real-time PCR-13法檢測宮頸脫落細胞HPV DNA對高度宮頸病變的篩查效能與HC-Ⅱ法相近，這與相關(guān)研究[15～19]結(jié)論一致。另外，本研究中宮頸慢性炎癥組real-time PCR-13法的HPV DNA檢出率高于HC-Ⅱ法，推測可能為宮頸慢性炎癥患者HPV病毒含量較低而real-time PCR對低濃度DNA敏感性較好所致。研究發(fā)現(xiàn)，當標本的HPV病毒含量低于1×104copies/mL時，PCR反向雜交法檢測結(jié)果可為陰性，這導致PCR反向雜交法在宮頸炎癥組標本中HPV DNA陽性檢出率較低。而隨著宮頸病變程度加重，HPV病毒負荷量及多重感染率均隨之上升，四種方法的檢出率也更加一致。

我們還發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)受檢者主要感染的高危型HPV為HPV52、16、33、58、18、39。通過基因分型還發(fā)現(xiàn)HC-Ⅱ法測得的高危型HPV與個別中低危型HPV(HPV6、HPV66)存在交叉反應，real-time PCR法檢測高危型HPV與個別中低危型HPV(HPV43、HPV53)也存在交叉反應，有助于提高高危型HPV的檢出率。HC-Ⅱ法與PCR反向雜交法靈敏度相近，且PCR反向雜交法的約登指數(shù)較高，這與徐華林等[20]的觀點一致。

綜上所述，采用real-time PCR-8、real-time PCR-13、PCR-反向雜交法及HC-Ⅱ法檢測宮頸脫落細胞HPV DNA對高度宮頸病變的篩查效能相近。

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余韜(E-mail：zy55421@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.019

R711.74

B

1002-266X(2016)19-0055-03

2016-01-25)