張正娥

(荊州市中心醫(yī)院·華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬荊州醫(yī)院，湖北荊州434020)

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RLIP76在子宮內膜癌組織中的表達變化及其對子宮內膜癌細胞凋亡的影響

張正娥

(荊州市中心醫(yī)院·華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬荊州醫(yī)院，湖北荊州434020)

目的觀察子宮內膜癌組織中人RalA結合蛋白1(RLIP76)的表達變化，以及沉默RLIP76基因表達后對子宮內膜癌細胞凋亡的影響。方法①子宮內膜癌組織中RLIP76表達觀察：采用免疫組化法檢測58例份子宮內膜癌組織、40例份子宮內膜不典型增生組織和40例份正常子宮組織中的RLIP76，分析RLIP76表達與子宮內膜癌臨床病理參數的關系。②RLIP76對子宮內膜癌細胞凋亡影響觀察：培養(yǎng)人子宮內膜癌Ishikawa細胞，分為RLIP76抑制組、陰性對照組和空白對照組，RLIP76抑制組轉染RLIP76 siRNA，陰性對照組轉染對照siRNA，空白對照組不做處理、常規(guī)培養(yǎng)；凋亡檢測試劑盒檢測凋亡細胞，Western blotting法檢測細胞中的Survivin、Caspase-3、Caspase-9蛋白。結果子宮內膜癌組織、子宮內膜不典型增生組織和正常子宮內膜組織中RLIP76陽性表達率分別為81.0%(47/58)、52.5%(21/40)、22.5%(9/40)，RLIP76在子宮內膜癌組織中的表達陽性率高于子宮內膜不典型增生組織和正常子宮內膜組織(P均<0.05)。RLIP76表達與子宮內膜癌患者淋巴結轉移有關(P<0.05)。RLIP76抑制組、陰性對照組、空白對照組細胞凋亡率分別為33.72%±3.25%、14.14%±3.19%、13.98%±2.97%，RLIP76抑制組細胞凋亡率高于陰性對照組、空白對照組(P均<0.05)。結論RLIP76蛋白在子宮內膜癌組織中高表達；沉默RLIP76基因表達后，子宮內膜癌細胞凋亡增多，推測RLIP76可能通過上調凋亡抑制因子表達、抑制凋亡相關基因表達參與子宮內膜癌的發(fā)生發(fā)展。

子宮內膜癌；人RalA結合蛋白1；基因沉默；細胞凋亡

子宮內膜癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機制尚未完全明確，但具有惡性程度高、侵襲力強等特點，患者預后較差[1]。人RalA結合蛋白1(RLIP76)是Ras超家族成員，定位于人18號染色體p11.3，可作為膜蛋白轉運體調控細胞內過氧化脂質體水平，亦可與Ral、Hsf-1等結合而活化相應信號通路，調控細胞增殖、分化及凋亡[2]。有研究[3]指出，RLIP76與惡性腫瘤的發(fā)生、進展有關，下調RLIP76表達可抑制腫瘤細胞侵襲，導致細胞周期阻滯[4]。本研究觀察了子宮內膜癌組織中RLIP76的表達變化，并利用RNA干擾技術沉默RLIP76，探討其在子宮內膜癌細胞凋亡中的作用，以期為臨床實踐提供基礎資料。

1　材料與方法

1.1子宮內膜癌組織及細胞2011年2月～2014年3月手術切除的子宮內膜癌標本58例份，患者年齡28～72(48.5±9.3)歲，病理分級Ⅰ級38例、Ⅱ級12例、Ⅲ級8例，FIGO分期Ⅰ期46例、Ⅱ期8例、Ⅲ期3例、Ⅳ期1例，患者術前均未行放化療治療。選擇同期手術切除的子宮內膜不典型增生標本40例份和正常子宮組織標本40例份。所有留取組織標本均保存于-70 ℃冰箱備檢。人子宮內膜癌Ishikawa細胞株由上海美軒生物科技有限公司提供，置于DMEM/F12培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清)，在含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2子宮內膜癌組織中RLIP76表達觀察取組織標本石蠟固定后切片，常規(guī)脫蠟水化，高溫高壓下抗原修復，用3% H2O2室溫下處理15 min，加入封閉液。加入兔抗人RLIP76單克隆抗體(購自上海麥倉生物科技有限公司)，室溫孵育60 min。DAB顯色，中性樹脂封片，用兔抗IgG替代一抗作為陰性對照，顯微鏡下觀察。結合陽性細胞百分比和染色強度判定結果：陽性細胞百分比為0計0分，≤10%計1分，>10%～25%計2分，>25%～50%計3分，>50%計4分；細胞質無染色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；兩項評分之和≤2分為陰性，≥3分為陽性。

1.3RLIP76對子宮內膜癌細胞凋亡影響觀察

1.3.1子宮內膜癌細胞分組及RLIP76 siRNA轉染RLIP76 siRNA和陰性對照siRNA序列由上海生工公司設計，序列分別為5′-GACUCCAGUGGUAAUCUACTT-3′、5′-GUAGAUUACCACUGGAGUCTT-3′,分別合成重組質粒pRNAT-RLIP76、pRNAT-neg。轉染前24 h將細胞按5×105/mL接種于6孔板，待細胞融合度達80%，用LipofectamineTM2000分別轉染pRNAT-RLIP76(RLIP76抑制組)和pRNAT-neg(陰性對照組)，以不做處理、常規(guī)培養(yǎng)的細胞作為空白對照組。將細胞板置于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)，每5 h更換1次培養(yǎng)基。采用real-time PCR法檢測RLIP76 mRNA，RLIP76抑制組細胞中RLIP76 mRNA相對表達量低于陰性對照組及空白對照組，說明RLIP76 siRNA轉染成功。

1.3.2凋亡細胞檢測各組細胞轉染48 h后，加入胰酶消化、離心，取1×106/mL細胞重懸于緩沖液中，取100 μL細胞懸液，加入Annexin V-FITC 5 μL和碘化丙啶10 μL，搖勻后室溫下暗室培養(yǎng)20 min，取出即刻用流式細胞儀檢測凋亡細胞。

1.3.3細胞中Survivin、Caspase-3、Caspase-9蛋白檢測轉染48 h后取各組細胞，用細胞裂解液裂解后提取總蛋白進行Western blotting檢測。取50 μg蛋白行SDS-PAGE電泳并電轉至PVDF膜上，室溫封閉60 min，分別將不同一抗[兔抗人Survivin單克隆抗體(1∶200)、兔抗Caspase-3單克隆抗體(1∶500)、小鼠抗Caspase-9單克隆抗體(1∶500)]加入，4 ℃過夜孵育，加入二抗，37 ℃下反應120 min，ECL試劑盒顯色，用雙色紅外熒光掃描系統(tǒng)分析,獲得目的蛋白相對表達量。

2　結果

2.1子宮內膜癌組織中RLIP76表達及其與腫瘤臨床病理參數的關系子宮內膜癌組織、子宮內膜不典型增生組織和正常子宮內膜組織中RLIP76陽性表達率分別為81.0%(47/58)、52.5%(21/40)、22.5%(9/40)，RLIP76在子宮內膜癌組織中的陽性表達率高于子宮內膜不典型增生組織和正常子宮內膜組織(P均<0.05)。RLIP76表達與子宮內膜癌患者淋巴結轉移有關(P<0.05)。見表1。

2.2各組子宮內膜癌細胞凋亡情況RLIP76抑制組、陰性對照組、空白對照組細胞凋亡率分別為33.72%±3.25%、14.14%±3.19%、13.98%±2.97%，RLIP76抑制組細胞凋亡率高于陰性對照組、空白對照組(P均<0.05)。詳見圖1。

表1　RLIP76表達與子宮內膜癌臨床病理參數的關系

注：與有淋巴結轉移者相比，*P<0.05。

注：A為RLIP76抑制組，B為陰性對照組，C為空白對照組。

圖1各組子宮內膜癌細胞凋亡情況

2.3各組子宮內膜癌細胞中Survivin、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達比較RLIP76抑制組Survivin蛋白相對表達量低于陰性對照組和空白對照組，Caspase-3、Caspase-9蛋白相對表達量高于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)。詳見表2。

表2　各組子宮內膜癌細胞中Survivin、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達比較

注：與RLIP76抑制組相比，*P<0.05。

3　討論

近年來，子宮內膜癌發(fā)病率不斷升高且呈低齡化趨勢[5]，雖然診療手段得到進步和發(fā)展，但患者5年生存率仍處于較低水平[6]。研究[7]表明，腫瘤細胞侵襲、轉移是子宮內膜癌患者預后較差的主要原因。RLIP76是Ral結合蛋白，在調控細胞生長、遷移、分裂和凋亡中發(fā)揮重要作用，主要表達于乳腺、心臟、肝臟和紅細胞中，在腦組織及結腸組織中表達較少[8]。RLIP76在腫瘤組織中表達異常增高，是PI3K/Akt、Racl-JNK等多種信號通路的關鍵性調控因子，而這些信號通路在腫瘤細胞增殖、遷移中發(fā)揮重要作用[9]。研究[10,11]表明，RLIP76在卵巢癌、肺癌等惡性腫瘤組織中高表達。潘海霞等[12]抑制小細胞肺癌H69細胞株中RLIP76表達后，發(fā)現細胞對化療藥物敏感性增強，認為RLIP76可能參與了小細胞肺癌多藥耐藥的產生，可作為小細胞肺癌化療敏感性和臨床預后的參考指標。

本研究觀察了子宮內膜癌組織中RLIP76的表達變化，發(fā)現RLIP76在子宮內膜癌組織中的陽性表達率高于子宮內膜不典型增生組織和正常子宮內膜組織，且RLIP76表達與子宮內膜癌患者淋巴結轉移有關，提示RLIP76的異常表達可能參與了子宮內膜癌的發(fā)病和侵襲。推測機制：RLIP76作為GTP酶激活蛋白家族成員，在細胞形態(tài)發(fā)生及細胞遷移中發(fā)揮重要作用，RLIP76過表達可能通過影響細胞生長、遷移、分裂和凋亡而參與子宮內膜癌的發(fā)病。

為進一步探討RLIP76在子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們利用RNA干擾技術沉默Ishikawa細胞株中RLIP76基因表達，然后發(fā)現，RLIP76抑制組細胞凋亡率高于陰性對照組和空白對照組，表明特異性沉默RLIP76基因可促使子宮內膜癌細胞凋亡。Survivin是一種凋亡抑制因子，能夠抑制多種刺激誘導的細胞凋亡，與多種腫瘤的發(fā)病有關[13]；Caspase-3和Caspase-9是Caspase家族重要成員，在細胞凋亡過程中，細胞色素C從線粒體中釋放，與凋亡蛋白酶活化因子結合，使Caspase-9前體活化[14]，進一步使Caspase-3蛋白前體活化，從而促使細胞發(fā)生凋亡[15,16]。本研究結果顯示，RLIP76抑制組Survivin蛋白相對表達量低于陰性對照組和空白對照組，Caspase-3、Caspase-9蛋白相對表達量高于陰性對照組和空白對照組，提示RLIP76可能通過上調凋亡抑制因子表達、抑制凋亡相關基因表達，從而使子宮內膜癌細胞躲避凋亡程序，實現異常增殖。

結合上述研究結果，我們認為，RLIP76在子宮內膜癌組織中高表達，與腫瘤淋巴結轉移有關；沉默RLIP76基因表達后子宮內膜癌細胞凋亡增多，推測RLIP76可能通過上調凋亡抑制因子表達、抑制凋亡相關基因表達參與子宮內膜癌的發(fā)生發(fā)展。

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