張曉敏，張英姿，胡雪穎，胡寧寧，孫聰聰

(1濱州醫(yī)學(xué)院，山東濱州256600；2濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

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子宮內(nèi)膜腺癌組織中RAD51、BRCA1蛋白的表達(dá)變化及其意義

張曉敏1，張英姿2，胡雪穎1，胡寧寧1，孫聰聰2

(1濱州醫(yī)學(xué)院，山東濱州256600；2濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

目的觀察子宮內(nèi)膜腺癌組織中DNA雙鏈修復(fù)蛋白(RAD51)、乳腺癌易感基因1(BRCA1)蛋白的表達(dá)變化，分析二者與子宮內(nèi)膜腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法 收集子宮內(nèi)膜腺癌組織52例、正常增生期子宮內(nèi)膜組織45例，采用免疫組化法檢測(cè)RAD51、BRCA1蛋白，分析RAD51、BRCA1蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果子宮內(nèi)膜腺癌組織、增生期子宮內(nèi)膜組織中BRCA1蛋白陽(yáng)性分別為21(40.4%)、42(93.3%)例，RAD51蛋白陽(yáng)性分別為42(80.8%)、7(15.6%)例，子宮內(nèi)膜腺癌組織與增生期子宮內(nèi)膜組織中BRCA1、RAD51蛋白陽(yáng)性表達(dá)率相比，P均<0.05。子宮內(nèi)膜腺癌組織BRCA1陽(yáng)性的21例中，RAD51陽(yáng)性9例；RAD51陽(yáng)性的33例中，BRCA1陽(yáng)性9例；BRCA1、RAD51蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.325，P<0.05)。BRCA1、RAD51蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌患者年齡、分化程度、FIGO分期、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無(wú)關(guān)(P均>0.05)。結(jié)論 子宮內(nèi)膜腺癌組織中BRCA1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率降低，而RAD51陽(yáng)性表達(dá)率升高；RAD51、BRCA1蛋白表達(dá)異?？赡芘c子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)病有關(guān)。

子宮內(nèi)膜腺癌；DNA雙鏈修復(fù)蛋白；乳腺癌易感基因1

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的惡性上皮性腫瘤，以腺癌最多見(jiàn)，占生殖道惡性腫瘤的20%～30%[1]。已知子宮內(nèi)膜腺癌與高雌激素水平、肥胖、高血壓、糖尿病、不孕癥及絕經(jīng)延遲、遺傳因素有關(guān)，但其具體發(fā)病機(jī)制仍未明確。目前尚無(wú)特異性腫瘤標(biāo)志物用以預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜腺癌[2]。DNA雙鏈修復(fù)蛋白(RAD51)和乳腺癌易感基因1(BRCA1)在DNA損傷修復(fù)的同源重組中起關(guān)鍵作用，其表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[3]。本研究觀察了子宮內(nèi)膜腺癌組織中RAD51、BRCA1蛋白的表達(dá)變化，分析二者與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2013～2015年留存的子宮內(nèi)膜腺癌組織蠟塊52例份，正常增生期子宮內(nèi)膜組織蠟塊45例份。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者有不規(guī)則陰道流血，排除妊娠、節(jié)育器移位或下移或崁頓、宮頸息肉或?qū)m頸贅生物或?qū)m頸癌造成的出血；患者出現(xiàn)癥狀前一年未曾口服雌激素類藥物或他莫西芬類藥物；患者未合并乳腺疾病、外陰疾病、卵巢良惡性腫瘤、胃腸道良惡性腫瘤等疾??；所有受試對(duì)象民族、生活地域、基礎(chǔ)疾病等一般情況均無(wú)明顯差異。其中子宮內(nèi)膜腺癌患者年齡36～70(55±8)歲，術(shù)前均未接受放化療或其他治療；腫瘤高分化32例，中低分化20例；FIGO分期Ⅰ、Ⅱ期40例，Ⅲ、Ⅳ期12例；浸潤(rùn)深度<1/2肌層39例，≥1/2肌層13例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例。

1.2RAD51、BRCA1蛋白檢測(cè)①免疫組化染色：將蠟塊以3 μm厚切片，經(jīng)二甲苯、無(wú)水乙醇、95%乙醇脫蠟至水，pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液高壓抗原熱修復(fù)，3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS緩沖液浸泡后加入一抗，4 ℃過(guò)夜，加入二抗，37 ℃孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水封片；將RAD51、BRCA1抗體以1∶100稀釋，染色步驟按說(shuō)明書進(jìn)行，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知RAD51陽(yáng)性乳腺癌組織切片及BRCA1陽(yáng)性正常乳腺組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照。②結(jié)果判定：以細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為RAD51陽(yáng)性表達(dá)，以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為BRCA1陽(yáng)性表達(dá)；每張切片選取10個(gè)視野，在高倍鏡(400×)下觀察，分別根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度計(jì)分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比≤25%計(jì)1分、>25%～50%計(jì)2分、>50%～75%計(jì)3分、>75%計(jì)4分，染色程度為無(wú)著色計(jì)0分、淡黃色計(jì)1分、棕黃色計(jì)2分、棕褐色計(jì)3分，兩項(xiàng)得分相乘，>3為陽(yáng)性、≤3為陰性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1子宮內(nèi)膜腺癌組織與增生期子宮內(nèi)膜組織中BRCA1、RAD51蛋白表達(dá)比較子宮內(nèi)膜腺癌組織、增生期子宮內(nèi)膜組織中BRCA1蛋白陽(yáng)性分別為21(40.4%)、42(93.3%)例，RAD51蛋白陽(yáng)性分別為42(80.8%)、7(15.6%)例，子宮內(nèi)膜腺癌組織與增生期子宮內(nèi)膜組織中BRCA1、RAD51蛋白陽(yáng)性表達(dá)率相比，P均<0.05。

2.2子宮內(nèi)膜腺癌組織中BRCA1、RAD51蛋白表達(dá)相關(guān)性子宮內(nèi)膜腺癌組織BRCA1陽(yáng)性的21例中，RAD51陽(yáng)性9例；RAD51陽(yáng)性的33例中，BRCA1陽(yáng)性9例；BRCA1、RAD51蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.325，P<0.05)。

2.3BRCA1、RAD51蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系BRCA1、RAD51蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌患者年齡、分化程度、FIGO分期、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無(wú)關(guān)(P均>0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1　BRCA1、RAD51蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

3　討論

近年來(lái)，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率升高，且發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)[3]。子宮內(nèi)膜癌的首選治療方式是手術(shù)治療，但對(duì)于希望保留子宮的年輕患者來(lái)說(shuō)難以接受，所以早期篩查尤為必要。CA125作為常用的腫瘤標(biāo)志物，能夠反映腫瘤患者術(shù)后預(yù)后及復(fù)發(fā)情況，但用于早期子宮內(nèi)膜癌篩查特異性及敏感性不高。Jiang等[4]報(bào)道只有25%的子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前血清CA125表達(dá)陽(yáng)性。因此，有必要尋找準(zhǔn)確性更高的指標(biāo)。

BRCA1是細(xì)胞核內(nèi)重要的磷酸化蛋白，可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，參與DNA損傷修復(fù)，其轉(zhuǎn)錄并編碼出的磷酸化蛋白上有DNA損傷修復(fù)相關(guān)功能區(qū)，如重組酶RAD51因子結(jié)合區(qū)、抑癌基因p53結(jié)合區(qū)。RAD51是大腸桿菌RecA蛋白同系物，具有DNA依賴性ATP激酶活性，其蛋白有多個(gè)致密區(qū)，靠氨基末端磷酸化來(lái)調(diào)控。以上BRCA1蛋白上的DNA損傷修復(fù)相關(guān)功能區(qū)、RAD51蛋白的致密區(qū)內(nèi)位點(diǎn)基因突變或磷酸化功能改變已被證實(shí)對(duì)DNA損傷修復(fù)產(chǎn)生明顯影響，從而導(dǎo)致乳腺癌、卵巢癌發(fā)病[5]。

大量體內(nèi)外因素如紫外線、放射線、烷化劑、化學(xué)致突變劑、DNA交聯(lián)劑、DNA修復(fù)抑制劑、DNA復(fù)制過(guò)程破壞及細(xì)胞生成過(guò)程中蛋白重組等均可致細(xì)胞DNA損傷，其中DNA雙鏈斷裂(DSB)被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的直接誘因。同源重組(HR)是指發(fā)生在同源DNA序列間的重組，其修復(fù)過(guò)程是DSB損傷修復(fù)的主要方式，對(duì)保持基因組完整性至關(guān)重要[6]。DSB修復(fù)過(guò)程中，BRCA1可引導(dǎo)識(shí)別DNA損傷，之后由RAD51作為HR的中心分子，合成新鏈進(jìn)而完成損傷修復(fù)，維持細(xì)胞穩(wěn)定性[7]。RAD51、BRCA1適當(dāng)表達(dá)對(duì)修復(fù)自發(fā)性DNA損傷是必須的，但異常表達(dá)可導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，受損細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞發(fā)展，并使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性[8]。

臨床放化療的機(jī)制是刺激細(xì)胞核內(nèi)DNA，使DNA鏈間或鏈內(nèi)交聯(lián)，導(dǎo)致雙鏈斷裂和損傷，從而抑制腫瘤細(xì)胞分裂、增殖，促進(jìn)其凋亡。RAD51、BRCA1是DNA損傷修復(fù)途徑中的重要基因，二者表達(dá)與腫瘤化放療敏感性有關(guān)。Tassone等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)順鉑耐藥的乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞系中，BRCA1表達(dá)水平明顯升高，而抑制BRCA1表達(dá)則可減弱DNA重組修復(fù)功能，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。Wang等[10]的體外細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但與腫瘤細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的敏感性呈正相關(guān)關(guān)系。張慧文等[11]也發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌的放療敏感性與BRCA1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。易俊林、Kong等[12，13]也得出了類似的結(jié)論。

我們觀察了子宮內(nèi)膜腺癌組織與正常子宮內(nèi)膜組織中BRCA1、RAD51蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜腺癌組織中BRCA1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率較低，而RAD51陽(yáng)性表達(dá)率較高，提示BRCA1、RAD51蛋白表達(dá)異?？赡軈⑴c了子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)病，可能是通過(guò)影響DNA損傷修復(fù)過(guò)程實(shí)現(xiàn)的。BRCA1、RAD51蛋白在子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而B(niǎo)RCA1是一種抑癌基因，我們可以推測(cè)RAD51是作為一種癌基因在組織中表達(dá)，兩者的聯(lián)合檢測(cè)更有助于提高診斷子宮內(nèi)膜腺癌的準(zhǔn)確性。我們進(jìn)一步分析了兩種蛋白與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，但可能由于樣本量較小，尚未發(fā)現(xiàn)BRCA1、RAD51蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌患者年齡、分化程度、FIGO分期、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等存在關(guān)聯(lián)，下一步將擴(kuò)大樣本深入研究。

總之，RAD51、BRCA1蛋白的表達(dá)異?？赡芘c子宮內(nèi)膜腺癌有關(guān)，但目前對(duì)RAD51、BRCA1的研究尚不全面，對(duì)于二者在DNA重組修復(fù)中的具體位置及相互作用、在不同腫瘤中的表達(dá)趨勢(shì)是否存在差異、對(duì)放化療敏感性的影響等方面仍有待于深入探討。

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