徐鋒，董惠，郝珂，楊誠，高蒙，熊雅靜，賴宇航，卞國強，孟晶，劉金東

(1徐州醫(yī)科大學麻醉學院，江蘇徐州221002；2徐州醫(yī)科大學江蘇省麻醉學重點實驗室)

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急性精神應激與生理應激對小鼠行為及學習記憶能力的影響對比觀察

徐鋒1，董惠1，郝珂1，楊誠1，高蒙1，熊雅靜1，賴宇航1，卞國強1，孟晶2，劉金東2

(1徐州醫(yī)科大學麻醉學院，江蘇徐州221002；2徐州醫(yī)科大學江蘇省麻醉學重點實驗室)

目的觀察并比較急性精神應激與生理應激對小鼠行為及學習記憶能力的影響。方法昆明種小鼠24只，隨機分為生理應激組、精神應激組和對照組，每組各8只。生理應激組小鼠在MG-3Y型迷宮內(nèi)接受電擊，精神應激組小鼠旁觀電擊過程，對照組小鼠正常飼養(yǎng)。記錄各組小鼠排便、排尿及修飾動作總次數(shù)。應激2 h后進行曠場實驗，記錄小鼠中央格爬行次數(shù)、外周格爬行次數(shù)、中央格百分比、排便粒數(shù)、修飾動作發(fā)生次數(shù)。采用Morris水迷宮進行定位航行實驗和空間搜索實驗，評價小鼠的學習記憶能力。結(jié)果應激過程中生理應激組小鼠的恐懼行為較精神應激組小鼠更為劇烈。在曠場實驗中，精神應激組小鼠直立次數(shù)、修飾次數(shù)、排便粒數(shù)少于對照組(P均<0.05)；生理應激組小鼠中央格及外周格爬行次數(shù)較精神應激組和對照組顯著減少(P均<0.05)；生理應激組小鼠中央格爬行次數(shù)、中央格百分比少于對照組，直立次數(shù)、修飾次數(shù)、排便粒數(shù)多于精神應激組(P均<0.05)。在Morris水迷宮實驗中，精神應激組與生理應激組在不同觀察時點逃避潛伏期呈現(xiàn)出先延長后縮短趨勢，其中第12次訓練時精神應激組逃避潛伏期最長，對照組次之，生理應激組最短(P均<0.05)。精神應激組小鼠平臺搜索策略多為隨機式；生理應激組和對照組小鼠的平臺搜索策略多為邊緣式和直線式。結(jié)論急性精神應激與生理應激對小鼠行為和學習記憶的影響存在較大差異。急性精神應激小鼠表現(xiàn)為抑郁狀態(tài)，而急性生理應激小鼠表現(xiàn)為空間探索和活動能力減弱。急性精神應激會干擾學習記憶能力，而急性生理應激會增強學習記憶能力。

應激反應；精神應激；生理應激；曠場實驗；Morris水迷宮；動物實驗

多項研究[1,2]發(fā)現(xiàn)，應激可影響觀察對象的學習記憶能力。既往建立動物應激反應模型的方法主要有電擊足底、限制性應激、束縛應激、強迫游泳等，這些在一定程度上均含有生理與精神應激的成分，不能很好地模擬現(xiàn)實生活中人類的精神應激[3]。上述造模方法未把精神應激與生理應激進行嚴格區(qū)分和比較。2015年6～7月，本研究分別建立了急性精神應激與生理應激小鼠模型，觀察并比較了兩種應激方式對小鼠行為及學習記憶能力的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物與材料同批次昆明種小鼠24只，雌雄不限，由徐州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗前2 d使小鼠熟悉實驗室環(huán)境，自由攝食、飲水。MG-3Y型迷宮刺激器及Y型迷宮購自安徽濉溪正華教學實驗器械廠，小鼠Morris水迷宮裝置、曠場實驗裝置(由不透明材料制成，長、寬、高各50 cm，底面等分為25個方格，敞箱底部及四周均為黑色)及ANY-maze version4.84系統(tǒng)(serial number:A2ST-3PJW-JS8W-TXKU)購自上海軟隆科技發(fā)展有限公司。

1.2動物分組與應激方法將24只小鼠隨機分為精神應激組、生理應激組和對照組，每組各8只。生理應激組小鼠在MG-3Y型迷宮內(nèi)接受電擊，位于三個通電臂內(nèi)，給予電壓36 V、周期5 s、間歇55 s，小鼠產(chǎn)生驚叫、驚跳、排便、排尿等反應；精神應激組不接受電擊，在MG-3Y型迷宮中央旁觀生理應激組小鼠遭受電擊的過程，通過視覺、聽覺、味覺等產(chǎn)生精神應激，每次應激在上午9：00～11：00進行，每次持續(xù)1 h、每天1次、共進行2 d；對照組小鼠放入另一個MG-3Y型迷宮，但不給予電刺激。

1.3小鼠行為評估方法精神應激組與生理應激組于最后一次應激過程中(對照組于同一時間)記錄小鼠排便、排尿及修飾動作(抓癢、洗臉、舔足等)總次數(shù)。急性應激結(jié)束2 h后進行曠場實驗，評價小鼠在新異環(huán)境中的自主行為、探究行為與緊張度。依次將小鼠輕輕放置于曠場實驗敞箱正中央格內(nèi)，觀察5 min內(nèi)活動情況，記錄小鼠中央格爬行次數(shù)、外周格爬行次數(shù)、中央格百分比(中央格數(shù)/總格數(shù))、排便粒數(shù)、修飾動作發(fā)生次數(shù)。當小鼠三爪或四爪跨入鄰格方能計數(shù)，并用ANY-maze version4.84系統(tǒng)監(jiān)測、記錄、分析。

1.4小鼠學習記憶能力評估方法曠場實驗結(jié)束后進行Morris水迷宮實驗[4]。迷宮由圓形水池、平臺及圖像采集處理系統(tǒng)組成。水池直徑80 cm、高30 cm，以兩條垂直的直徑為界限人為地將圓形水池等分為四個象限，平臺位于第三象限中間位置。在第三象限池壁中間放置一白色標記。水溫(22±1)℃，水位高出平臺1 cm。采用定位航行實驗和空間搜索實驗評估小鼠的學習記憶能力。①定位航行實驗：將小鼠從四個象限中心放入水中，記錄小鼠入水至找到平臺并停留10 s所用時間(即逃避潛伏期)，若在平臺停留不足10 s再次入水則繼續(xù)計時；若小鼠60 s內(nèi)未找到平臺，則引其上平臺停留10 s，逃避潛伏期記為60 s；實驗第1、2天共進行4個周期訓練，每周期訓練4次，分別于上午8:00～11:00及下午2:00～5:00進行，記錄第4、8、12、16次訓練時逃避潛伏期。②空間搜索實驗：實驗第3天8:00～10:00進行空間搜索實驗，取出平臺，將第一象限作為入水點把小鼠放入水中，記錄小鼠60 s內(nèi)在水迷宮第一、二、三、四象限的游泳時間。由圖像自動采集處理系統(tǒng)生成小鼠游泳路線圖，據(jù)此分析小鼠搜索平臺的策略。搜索策略主要分為邊緣式、隨機式、直線式、趨向式。以小鼠運動區(qū)域中心為圓心，取半徑的75%畫圓，若小鼠70%以上時間均在該圓外活動，判定為邊緣式策略；以小鼠入水點與平臺中心連線為中軸，若小鼠所有運動軌跡與中軸距離不超過半徑的15%，且在該區(qū)域活動時間占總運動時間的70%以上，則判定為直線式策略；以小鼠入水點與平臺中心連線為中軸，若小鼠所有運動軌跡與中軸距離不超過半徑的50%，且在該區(qū)域活動時間占總運動時間的70%以上，則判定為趨向式策略；若實驗動物的運動方式與以上三者不同稱為隨機式策略。癡呆小鼠的搜索策略將發(fā)生異常，如只有邊緣式→隨機式或隨機式→邊緣式，趨向式、直線式少見。

2　結(jié)果

2.1各組小鼠行為變化生理應激組小鼠在接受電擊時，出現(xiàn)尖叫、掙扎跳躍、排便、排尿等恐懼行為；精神應激組小鼠旁觀生理應激組小鼠接受電擊時，表現(xiàn)木僵、顫栗、驚恐注視、排便、排尿、頻繁修飾等應激行為。生理應激組小鼠的恐懼行為較精神應激組小鼠更為劇烈。將生理應激組小鼠第二次放入電擊箱時，小鼠極力掙扎，出現(xiàn)排便、排尿現(xiàn)象，表明小鼠已形成恐懼記憶。生理應激組小鼠排尿次數(shù)、修飾次數(shù)、排便粒數(shù)分別為20次、258次和47粒，精神應激組分別為12次、195次、31粒，對照組分別為11次、161次、32粒，生理應激組、精神應激組小鼠排尿次數(shù)、修飾次數(shù)較對照組增多，其中生理應激組多于精神應激組(P均<0.05)。曠場試驗中，精神應激組小鼠直立次數(shù)、修飾次數(shù)、排便粒數(shù)少于對照組(P均<0.05)；生理應激組小鼠中央格及外周格爬行次數(shù)較精神應激組和對照組顯著減少(P均<0.05)；生理應激組中央格爬行次數(shù)、中央格百分比少于對照組，直立次數(shù)、修飾次數(shù)、排便粒數(shù)多于精神應激組(P均<0.05)。詳見表1。

表1　各組小鼠曠場實驗結(jié)果

注：與對照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與精神應激組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2各組小鼠學習記憶能力變化精神應激組與生理應激組小鼠第4、8、12、16次訓練時逃避潛伏期呈現(xiàn)出先延長后縮短的趨勢，其中第12次訓練時精神應激組逃避潛伏期最長，對照組次之，生理應激組最短(P均<0.05)。見表2?？臻g搜索實驗結(jié)果顯示，三組小鼠在水迷宮不同象限游泳時間差異無統(tǒng)計學意義(見表3)。精神應激組小鼠平臺搜索策略多為隨機式；生理應激組和對照組小鼠的平臺搜索策略多為邊緣式和直線式。

表2　應激后不同時間各組小鼠逃避潛伏期比較±s)

注：與對照組相比，*P<0.05；與精神應激組相比，#P<0.05。

3　討論

精神應激因素為情感、心理方面，生理應激因素側(cè)重軀體方面[5]。生理應激因素有別于精神應激因素[3]，以往常用的精神應激模型制作方法未把精神應激與生理應激進行嚴格區(qū)分和比較。急性應激狀態(tài)下，海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)不發(fā)生明顯變化，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)功能未受損傷[6]。急性生理應激對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響可能不涉及到器質(zhì)性改變；但較為強烈而持久的慢性應激足以損害海馬組織結(jié)構(gòu)，嚴重影響學習記憶能力[7,8]。Jeon等[9]對旁觀電擊鼠模型進行研究發(fā)現(xiàn)，在旁觀學習中，有前扣帶回皮層(ACC)及杏仁體參與。Kim等[10]也指出“旁觀恐懼學習”的過程受ACC支配。以上研究結(jié)果表明，急性精神應激與生理應激的神經(jīng)內(nèi)分泌、神經(jīng)解剖、神經(jīng)電生理等機制均存在明顯差異[11～13]。

表3　各組小鼠在水迷宮不同象限游泳次數(shù)(次，±s)

本研究分別通過不同方式制作生理應激與精神應激小鼠模型，發(fā)現(xiàn)生理應激組小鼠的恐懼行為較精神應激組小鼠更為劇烈。生理應激組、精神應激組小鼠排尿次數(shù)、修飾次數(shù)較對照組增多，其中生理應激組多于精神應激組。這說明旁觀電擊造?？梢允剐∈螽a(chǎn)生精神應激和焦慮行為,而這種精神應激模型的應激強度和焦慮水平都遠低于生理應激模型。在曠場實驗中，精神應激組小鼠直立次數(shù)、修飾次數(shù)及排便粒數(shù)較少，提示精神應激小鼠處于一種抑郁狀態(tài)，對于陌生環(huán)境(曠場實驗箱)并未表現(xiàn)出較多的焦慮行為。生理應激組小鼠中央格爬行次數(shù)、外周格爬行次數(shù)、中央格百分比較少，提示急性生理應激小鼠的空間活動和探索能力減弱，更趨向在外周格活動。

我們利用Morris水迷宮實驗，從四個時點觀察應激小鼠學習記憶能力的變化，結(jié)果顯示，在定位航行實驗中，各組小鼠的逃避潛伏期呈現(xiàn)出先延長后縮短的趨勢，其中第12次訓練時精神應激組逃避潛伏期最長，對照組次之，生理應激組最短；在空間搜索實驗中，各組小鼠在水迷宮不同象限的游泳時間無統(tǒng)計學差異。這些結(jié)果提示應激對小鼠學習記憶能力的影響有一定時間依賴性，應激水平隨時間延長會出現(xiàn)衰減，從而減弱或消除對小鼠學習記憶能力的干擾；同時，急性生理應激可增強小鼠的學習記憶能力，而急性精神應激會干擾學習記憶能力。我們還發(fā)現(xiàn)，生理應激組及對照組小鼠的平臺搜索策略較為規(guī)則有效，而精神應激組小鼠的搜索策略較不規(guī)則，這也進一步驗證了急性精神應激對小鼠學習記憶能力的干擾作用，與之前的研究[14,15]結(jié)果一致。

結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認為，急性精神應激與生理應激對小鼠行為和學習記憶的影響存在較大差異。急性精神應激小鼠更多表現(xiàn)為一種抑郁狀態(tài)，而急性生理應激小鼠表現(xiàn)為空間探索和活動能力減弱。急性精神應激會干擾學習記憶能力，而急性生理應激會增強學習記憶能力。

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江蘇省高等學校大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201510313075X)。

孟晶(E-mail：mengjingmz@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.013

R395.1

A

1002-266X(2016)19-0039-03

2015-12-15)