葉佳，楊曉清，盛楠，馬勤宜，張玉泉

(1南通大學附屬醫(yī)院，江蘇南通226001;2南通市婦幼保健院)

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不同子宮內(nèi)膜癌細胞系中G蛋白耦聯(lián)受體30 mRNA及蛋白表達觀察

葉佳1*，楊曉清1，盛楠1，馬勤宜2，張玉泉1

(1南通大學附屬醫(yī)院，江蘇南通226001;2南通市婦幼保健院)

目的觀察不同子宮內(nèi)膜癌細胞系中G蛋白耦聯(lián)受體30(GPR30)mRNA及蛋白的表達變化。方法收集正常增生期人子宮內(nèi)膜組織，原代培養(yǎng)子宮內(nèi)膜腺上皮細胞并鑒定。體外培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜癌細胞系ISK(ERα陽性、ERβ陽性、高分化)、RL95-2(ERα陽性、ERβ陽性、中分化)、HEC-1-B(ERα陰性、ERβ陽性、中分化)、KLE(ERα陰性、ERβ陰性、低分化)。采用real-time PCR法檢測正常子宮內(nèi)膜腺上皮細胞及不同子宮內(nèi)膜癌細胞系中的GPR30 mRNA，采用Western blotting法檢測GPR30蛋白。結(jié)果子宮內(nèi)膜腺上皮細胞、ISK細胞系、RL95-2細胞系、HEC-1-B細胞系、KLE細胞系中GPR30 mRNA相對表達量分別為0.016±0.002、0.032±0.004、0.049±0.003、0.051±0.006、0.083±0.001，GPR30蛋白相對表達量分別為0.31±0.22、0.57±0.01、1.21±0.04、1.34±0.05、1.77±0.01。各子宮內(nèi)膜癌細胞系中GPR30 mRNA及蛋白相對表達量均高于子宮內(nèi)膜腺上皮細胞(P均<0.05)；ISK細胞系中GPR30 mRNA及蛋白相對表達量最低，與RL95-2細胞系、HEC-1-B細胞系、KLE細胞系相比，P均<0.05；KLE細胞系中GPR30 mRNA及蛋白相對表達量高于HEC-1-B細胞系及RL95-2細胞系(P均<0.05)。結(jié)論不同子宮內(nèi)膜癌細胞系中GPR30 mRNA及蛋白均呈高表達，且在高、中、低分化的子宮內(nèi)膜癌細胞系中表達水平逐漸增高。

子宮內(nèi)膜癌；子宮內(nèi)膜癌細胞系；G蛋白耦聯(lián)受體30；孕激素受體；子宮內(nèi)膜腺上皮細胞

近年來研究發(fā)現(xiàn)，雌激素作用于靶細胞后可引起快速細胞反應(yīng)，僅需幾秒到幾分鐘即可發(fā)揮生物效應(yīng)，此過程與傳統(tǒng)的雌激素基因組效應(yīng)不同，并不激活相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，因此稱為雌激素的“非基因組效應(yīng)”。G蛋白耦聯(lián)受體30(GPR30)在介導(dǎo)這種效應(yīng)中起到重要作用[1]，被認為是一種新型雌激素受體。GPR30介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能在腫瘤細胞(尤其是ERα、ERβ陰性的Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌細胞)的增殖及遷移中起關(guān)鍵作用[2]。2010年8月～2013年1月，我們觀察了不同子宮內(nèi)膜癌細胞系中GPR30 mRNA及蛋白的表達變化，探討GPR30在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1　材料與方法

1.1主要實驗材料人子宮內(nèi)膜癌細胞系ISK(ERα陽性、ERβ陽性、高分化)購自湘雅醫(yī)學院細胞中心(由南通大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科實驗室保存)，人子宮內(nèi)膜癌細胞系RL95-2(ERα陽性、ERβ陽性、中分化)、HEC-1-B(ERα陰性、ERβ陽性、中分化)購自中科院上海細胞庫，人子宮內(nèi)膜癌細胞系KLE(ERα陰性、ERβ陰性、低分化)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。RPMI1640、MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，DMEM-F12培養(yǎng)基購自美國Sigma公司，TRIzol試劑購自美國Introvigen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于杭州博日科技有限公司，real-time PCR試劑盒購于TaKaRa生物有限公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒增強型、小鼠抗人β-actin單克隆抗體購自碧云天生物技術(shù)研究所，兔抗人GPR30多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG購于美國Odyssey公司，F(xiàn)ITC標記羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2子宮內(nèi)膜腺上皮細胞獲取及子宮內(nèi)膜癌細胞系培養(yǎng)

1.2.1子宮內(nèi)膜腺上皮細胞獲取方法正常增生期子宮內(nèi)膜組織取自2010年8～11月因子宮肌瘤(非黏膜下肌瘤)在南通大學附屬醫(yī)院行全子宮切除術(shù)的患者?；颊吣挲g20～45歲，月經(jīng)周期正常，未放置宮內(nèi)節(jié)育器，近3個月未口服藥物避孕，術(shù)后病理證實子宮內(nèi)膜正常。參考文獻[3]方法并適當改進，分離培養(yǎng)8例患者的子宮內(nèi)膜腺上皮細胞，細胞純度>95%。免疫熒光化學檢查結(jié)果顯示細胞角蛋白染色陽性、波形蛋白染色陰性，證明所得細胞為子宮內(nèi)膜腺上皮細胞。

1.2.2子宮內(nèi)膜癌細胞系培養(yǎng)方法ISK細胞培養(yǎng)液為RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加10%FBS、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素。RL95-2細胞培養(yǎng)液為DMEM-F12培養(yǎng)基添加10 mmol/L HEPES、2.0 g/L碳酸氫鈉、0.005 mg/mL胰島素、10%FBS、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素。HEC-1-B細胞培養(yǎng)液為E-MEM培養(yǎng)基添加1.0 mmol/L丙酮酸鈉、0.1 mmol/L非必需氨基酸、1.5 g/L碳酸氫鈉、10% FBS、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素。KLE細胞培養(yǎng)液為DMEM-F12培養(yǎng)基添加15 mmol/L HEPES、0.5 mmol/L丙酮酸鈉、1.2 g/L碳酸氫鈉、2.5 mmol/L L-谷氨酰胺、10%FBS、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素。細胞均在37 ℃、含5% CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。四種細胞均貼壁生長，每2～3 d用0.25%胰酶消化傳代。

1.3不同細胞中GPR30 mRNA及蛋白檢測

1.3.1GPR30 mRNA檢測取對數(shù)生長期細胞，TRIzol法提取子宮內(nèi)膜腺上皮細胞和子宮內(nèi)膜癌細胞的總RNA。紫外分光光度計測總RNA OD260/OD280在1.8～2.0。從NCBI獲得GPR30 mRNA及內(nèi)參β-actin mRNA全序列，利用Primer Remier5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計引物，由上海生工生物工程有限公司合成引物。目的基因引物序列及產(chǎn)物長度見表1。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，按照試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)液。取cDNA 2 μL，使總反應(yīng)體系為25 μL，采用兩步法PCR反應(yīng)檢測GPR30 mRNA。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環(huán)。由Opticon Monitor2軟件分析PCR擴增產(chǎn)物原始Ct值，以2-ΔΔCt表示GPR30 mRNA相對表達量。實驗重復(fù)3次，取均值。

表1　目的基因引物序列及產(chǎn)物長度

1.3.2GPR30蛋白檢測采用Western blotting法。收集各組對數(shù)生長期細胞，提取蛋白，BCA法測蛋白濃度；蛋白上樣15 μg，經(jīng)10% SDS-PAGE恒壓電泳，恒流電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，TBST漂洗；分別加入小鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 000稀釋)和兔抗人GPR30多克隆抗體(1∶200稀釋)，4 ℃孵育過夜；次日加入HRP標記的羊抗兔、羊抗小鼠IgG(1∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃膜成像，Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值。以GPR30條帶與β-actin條帶灰度值之比作為GPR30蛋白相對表達量。實驗重復(fù)3次，取均值。

2　結(jié)果

各子宮內(nèi)膜癌細胞系中GPR30 mRNA及蛋白相對表達量均高于子宮內(nèi)膜腺上皮細胞(P均<0.05)；ISK細胞系中GPR30 mRNA及蛋白相對表達量最低，與RL95-2細胞系、HEC-1-B細胞系、KLE細胞系相比，P均<0.05；KLE細胞系中GPR30 mRNA及蛋白相對表達量高于HEC-1-B細胞系及RL95-2細胞系(P均<0.05)。詳見表2。

表2　子宮內(nèi)膜腺上皮細胞與各子宮內(nèi)膜癌細胞系中GPR30 mRNA及蛋白表達比較

注：與子宮內(nèi)膜腺上皮細胞相比，*P<0.05；與ISK細胞系相比，#P<0.05；與RL95-2細胞系、HEC-1-B細胞系相比，▲P<0.05。

3　討論

GPR30為7次跨膜G蛋白耦聯(lián)受體超家族(GPCRs)成員之一，基因位于染色體7p22，全長為2 064 bp，含一長為1 128 bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個含375個氨基酸的蛋白質(zhì)。該蛋白含有1個7次跨膜的高度保守域、3個位于細胞外區(qū)域的糖基化位點[4]。GPR30分布于大腦、心臟、血管內(nèi)皮、淋巴組織、子宮內(nèi)膜、卵巢、胎盤等正常組織中[5]，在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、睪丸癌等多種惡性腫瘤中亦有廣泛表達[6～9]，其表達水平因腫瘤組織類型、病理狀態(tài)不同而各有差異，可能參與了激素相關(guān)性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。隨著GPR30特異性配體G-1[11]與特異性拮抗劑G-15[12]的發(fā)現(xiàn)，GPR30的生物學功能得到進一步揭示。

Kolkova等[13]研究發(fā)現(xiàn)GPR30主要定位表達于增生中晚期的子宮內(nèi)膜腺上皮組織中，且在腺上皮細胞中的表達水平高于基質(zhì)細胞。因此我們選擇正常增生期的子宮內(nèi)膜組織，且在原代培養(yǎng)過程中棄去基質(zhì)細胞，僅選擇分離、純化出的腺上皮細胞作為實驗對象。Ge等[14]研究顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中GPR30的表達水平與EGF呈正相關(guān)關(guān)系，與PR的表達呈負相關(guān)關(guān)系，與ER表達無相關(guān)性。過表達GPR30蛋白的腫瘤組織分化程度較低，常伴深肌層浸潤，患者預(yù)后較差。GPR30或可成為子宮內(nèi)膜癌患者不良結(jié)局的預(yù)測指標。Vivacqua等[15]研究表明，雌激素與GPR30結(jié)合后，能激活GPR30下游的ERK/MAPK信號通路，使c-fos原癌基因表達上調(diào)，從而誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，此過程與子宮內(nèi)膜癌細胞內(nèi)ERα存在與否無關(guān)，提示GPR30可能在ER陰性的Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。

我們前期研究已發(fā)現(xiàn)GPR30在子宮內(nèi)膜癌細胞系ISK細胞質(zhì)中的表達高于細胞膜，其亞細胞定位主要在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[16]。為了進一步擴大研究，我們體外培養(yǎng)了不同特點的人子宮內(nèi)膜癌細胞系，觀察各細胞系中GPR30 mRNA及蛋白的表達變化。四種癌細胞系分別為高、中、低分化級別，其中ISK、RL95-2中ERα、ERβ陽性，HEC-1-B、KLE中ERα、ERβ陰性，RL95-2、HEC-1-B同為中分化級別，但ERα、ERβ的表達有差異。本研究結(jié)果顯示，GPR30 mRNA及蛋白在四種子宮內(nèi)膜癌細胞系中的表達均高于正常子宮內(nèi)膜腺上皮細胞，在低分化的KLE細胞系中表達量最高，在高分化的ISK細胞系中表達量最低。上述結(jié)果提示不同子宮內(nèi)膜癌細胞系中GPR30 mRNA及蛋白均呈高表達，且在高、中、低分化的子宮內(nèi)膜癌細胞系中表達水平逐漸增高；GPR30表達與子宮內(nèi)膜癌細胞分化程度有關(guān)，其可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展。GPR30有望成為子宮內(nèi)膜癌的一個新的治療靶點。在后續(xù)研究中，我們將繼續(xù)探索GPR30的相關(guān)作用機制。

[1] Ariazi EA,Brailoiu E,Yerrum S,et al.The G protein-coupled receptor GPR30 inhibits proliferation of estrogen receptor-positive breast cancer cells [J].Cancer Res,2010,70(3):1184-1194.

[2] Lappano R,Rosano C,Santolla MF,et al.Two novel GPER agonists induce gene expression changes and growth effects in cancer cells[J].Curr Cancer Drug Targets,2012,12(5):531-542.

[3] 楊曉清,張沐,唐小軍,等.人子宮內(nèi)膜細胞的純化、培養(yǎng)方法的改進及細胞保存[J].江蘇醫(yī)藥,2012,38(4):389-392.

[4] Wang D,Hu L,Zhang G,et al.G protein-coupled receptor 30 in tumor development[J].Endocrine,2010,38(1):29-37.

[5] Cygankiewicz AI,Jacenik D,Krajewska WM,et al.GPER receptor - the new player in estrogen signaling[J].Postepy Biochem,2015,61(1):52-60.

[6] Marjon NA,Hu C,Hathaway HJ,et al.G protein-coupled estrogen receptor regulates mammary tumorigenesis and metastasis[J].Mol Cancer Res,2014,12(11):1644-1654.

[7] Du GQ,Zhou L,Chen XY,et al.The G protein-coupled receptor GPR30 mediates the proliferative and invasive effects induced by hydroxytamoxifen in endometrial cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,420(2):343-349.

[8] Heublein S,Mayr D,Friese K,et al.The G-protein-coupled estrogen receptor (GPER/GPR30) in ovarian granulosa cell tumors[J].Int J Mol Sci,2014,15(9):15161-15172.

[9] Boscia F,Passaro C,Gigantino V,et al.High levels of GPR30 protein in human testicular carcinoma in situ and seminomas correlate with low levels of estrogen receptor-beta and indicate a switch in estrogen responsiveness[J].J Cell Physiol,2015,230(6):1290-1297.

[10] Arias-Pulido H,Royce M,Gong Y,et al.GPR30 and estrogen receptor expression: new insights into hormone dependence of inflammatory breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2010,123(1):51-58.

[11] Skrzypczak M,Schüler S,Lattrich C,et al.G protein-coupled estrogen receptor (GPER) expression in endometrial adenocarcinoma and effect of agonist G-1 on growth of endometrial adenocarcinoma cell lines[J].Steroids,2013,78(11):1087-1091.

[12] Méndez-Luna D,Martínez-Archundia M,Maroun RC,et al.Deciphering the GPER/GPR30-agonist and antagonists interactions using molecular modeling studies,molecular dynamics,and docking simulations[J].J Biomol Struct Dyn,2015,33(10):2161-2172.

[13] Kolkova Z,Noskova V,Ehinger A,et al.G protein-coupled estrogen receptor 1 (GPER,GPR 30) in normal human endometrium and early pregnancy decidua(dagger)[J].Mol Hum Reprod,2010,16(10):743-751.

[14] Ge X,Guo R,Qiao Y,et al.The G protein-coupled receptor GPR30 mediates the nontranscriptional effect of estrogen on the activation of PI3K/Akt pathway in endometrial cancer cells[J].Int J Gynecol Cancer,2013,23(1):52-59.

[15] Vivacqua A,Romeo E,De Marco P,et al.GPER mediates the Egr-1 expression induced by 17β-estradiol and 4-hydroxitamoxifen in breast andendometrial cancer cells[J].Breast Cancer Res Treat,2012,133(3):1025-1035.

[16] 葉佳,張沐,馬勤宜,等.G蛋白偶聯(lián)受體30在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中的表達及亞細胞定位[J].腫瘤,2011,31(11):977-981.

南通市科技計劃項目(K2010043)；南通大學研究生科技創(chuàng)新計劃項目(YKC11013)。

張玉泉(E-mail: jsnt_zhangyuquan@163.com)

*現(xiàn)工作于南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.010

R711.74

A

1002-266X(2016)19-0031-03

2016-02-14)