何金英，趙鵬偉，姚星宇，馬玉珍，孫文芳，劉慧，侯建華，楊麗敏

(1內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，呼和浩特010059；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院；3呼倫貝爾市中蒙醫(yī)院；4內(nèi)蒙古蒙健生物公司)

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馬鈴薯提取液對人卵巢癌細胞株HO-8910增殖及磷酸化ERK1/2蛋白表達的影響

何金英1，趙鵬偉2，姚星宇3，馬玉珍1，孫文芳1，劉慧1，侯建華1，楊麗敏4

(1內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，呼和浩特010059；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院；3呼倫貝爾市中蒙醫(yī)院；4內(nèi)蒙古蒙健生物公司)

目的觀察馬鈴薯提取液對人卵巢癌細胞增殖及磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)蛋白表達的影響。方法培養(yǎng)人卵巢癌細胞株HO-8910，待98%細胞生長狀態(tài)良好、長滿96孔細胞培養(yǎng)板時開始實驗。將細胞分為實驗1、2、3、4組及對照組。實驗1、2、3、4組分別加入13、25、50、100 μL/mL的馬鈴薯提取液，對照組不添加。各組分別于培養(yǎng)24、48、72 h采用MTT法檢測光密度值(OD值)，計算細胞增殖抑制率。收集各組細胞，分別于培養(yǎng)0、10、20、40 min采用Western blotting法檢測磷酸化ERK1/2蛋白。結(jié)果培養(yǎng)24 h時實驗4組細胞增殖抑制率高于實驗1、2、3組(P均<0.05)；培養(yǎng)48 h時實驗3、4組細胞增殖抑制率高于實驗1組，實驗4組細胞增殖抑制率高于實驗2組(P均<0.05)；培養(yǎng)72 h時實驗2、3、4組細胞增殖抑制率高于實驗1組(P均<0.05)。培養(yǎng)20、40 min時實驗3組細胞中磷酸化ERK1/2蛋白相對表達量低于同組培養(yǎng)0、10 min時(P均<0.05)；培養(yǎng)20、40 min時實驗3組細胞中磷酸化ERK1/2蛋白相對表達量低于同時點實驗1、2、4組(P均<0.05)。結(jié)論馬鈴薯提取液可抑制人卵巢癌細胞增殖，并下調(diào)細胞內(nèi)磷酸化ERK1/2蛋白表達。

馬鈴薯提取液；卵巢癌；人卵巢癌細胞；細胞增殖;細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2

目前學界對馬鈴薯的研究主要集中于營養(yǎng)價值方面，對其生物活性和藥用價值少有報道。有研究[1～3]稱馬鈴薯有抗菌、抗病毒、抗寄生蟲的作用，可用于輔助治療口腔炎、急性乳腺炎和急性睪丸炎；馬鈴薯外敷可防治惡性腫瘤化療患者化學性靜脈炎，防治動靜脈內(nèi)瘺；馬鈴薯勻漿局部涂抹可緩解靜脈補鉀患者的局部疼痛等。近年研究[4]發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯可抑制結(jié)腸癌細胞株HT-29增殖并將細胞周期阻滯在G2/M期，馬鈴薯中的綠原酸可抑制肝癌、腸癌及大鼠喉癌的發(fā)生，馬鈴薯中的色素、花青素對人白血病細胞株K562、低分化胃腺癌細胞株BGC-823、前列腺癌細胞均有明顯的增殖抑制作用[5～7]。2015年1～11月，我們觀察了馬鈴薯提取液對人卵巢癌細胞增殖及磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)蛋白表達的影響，探討馬鈴薯對卵巢癌細胞的作用及其機制。

1　材料與方法

1.1主要實驗材料馬鈴薯提取液(本實驗室提供)，人卵巢癌細胞株HO-8910(購自中國科學院細胞庫)，DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，MTT試劑盒(Sigma公司)，DMSO(Sigma公司)，胎牛血清(FBS,美國Gibco公司)，胰蛋白酶(美國Gibco公司)，EDTA(華美生物工程公司)，ERK1/2、磷酸化ERK1/2抗體(Abcam公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(日本日立公司)，倒置顯微鏡(德國Leica公司)，DZG-303A離子純水機(美國摩爾公司)，酶標儀(美國Thermo公司)，PCR熱循環(huán)儀(美國ABI公司)，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(美國博樂公司)，96孔培養(yǎng)板(美國Corning公司)。

1.2細胞分組與馬鈴薯提取液用法在超凈臺中將馬鈴薯提取液用0.22 μm濾膜除菌，備用。培養(yǎng)HO-8910細胞，待98%細胞生長狀態(tài)良好、長滿96孔細胞培養(yǎng)板時開始實驗。將細胞分為實驗1、2、3、4組及對照組。實驗1、2、3、4組分別加入13、25、50、100 μL/mL的馬鈴薯提取液，對照組不添加。每組均設3個復孔。將各組細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3細胞增殖抑制率測算各組分別于培養(yǎng)24、48、72 h后加入15 μL MTT(5 g/L)繼續(xù)溫育4 h，棄去原培養(yǎng)液，加入DMSO 100 μL/孔，微型振蕩器振蕩1～2 min。使用酶標儀測定光密度值(OD值)，按公式計算細胞增殖抑制率：增殖抑制率=(空白對照孔OD值-實驗孔OD值)/對照孔OD值×100%。

1.4磷酸化ERK1/2蛋白檢測收集各組細胞，分別于培養(yǎng)0、10、20、40 min時檢測ERK1/2蛋白。用預冷的PBS洗滌3次，將PBS棄凈后把EP管置于冰上，每管加含PMSF的裂解液冰上裂解30 min；將蛋白樣品與等體積上樣緩沖液混合，100 ℃水浴5 min，待完全冷卻后用12% SDS-PAGE電泳；將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂奶粉封閉，加1∶1 000稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗2次，TBS洗1次；加入1∶3 000稀釋的堿性磷酸酶標記的二抗IgG,室溫振蕩孵育1 h，TBST洗2次，TBS洗1次；將ECL試劑盒中底物液A液和B液按1∶1混合，滴在NC膜蛋白面上1 min，甩干后顯影并拍照；將同一張NC膜與內(nèi)參GAPDH一抗(1∶1 000)進行雜交。用Fluors Mutilmager圖像分析儀(Bio-Rad公司)上的Quantity One4.1軟件分析結(jié)果，以目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

2　結(jié)果

2.1各實驗組細胞增殖抑制率比較培養(yǎng)24 h時實驗4組細胞增殖抑制率高于實驗1、2、3組(P均<0.05)；培養(yǎng)48 h時實驗3、4組細胞增殖抑制率高于實驗1組，實驗4組細胞增殖抑制率高于實驗2組(P均<0.05)；培養(yǎng)72 h時實驗2、3、4組細胞增殖抑制率高于實驗1組(P均<0.05)。見表1。

表1　各實驗組細胞增殖抑制率比較±s)

注：與實驗1組相比，#P<0.05；與實驗2組相比，★P<0.05；與實驗3組相比，△P<0.05。

2.2各組細胞中磷酸化ERK1/2蛋白表達比較培養(yǎng)20、40 min時實驗3組細胞中磷酸化ERK1/2蛋白相對表達量低于同組培養(yǎng)0、10 min時(P均<0.05)；培養(yǎng)20、40 min時實驗3組細胞中磷酸化ERK1/2蛋白相對表達量低于同時點實驗1、2、4組(P均<0.05)。詳見表2。

3　討論

卵巢癌是常見的女性生殖系統(tǒng)腫瘤，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已喪失最佳手術(shù)時機，給治療帶來困難?，F(xiàn)階段化療仍是卵巢癌的主要治療手段，但腫瘤對化療藥物耐藥性及化療藥物不良反應(如消化道反應及腎毒性)一直是卵巢癌化療研究中的難題。近年來，卵巢癌化療藥的治療效果已趨于平緩，急需找到更加安全有效的治療策略。馬鈴薯是我國傳統(tǒng)食物，近年研究[8～10]發(fā)現(xiàn)其有很強的抗菌、抗病毒、抗寄生蟲的作用，但馬鈴薯提取物對腫瘤細胞的作用及其機制尚未明確。本實驗制備了馬鈴薯提取液，配制成不同濃度溶液，分別作用于HO-8910細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)24 h時實驗4組細胞增殖抑制率高于實驗1、2、3組；培養(yǎng)48 h時實驗3、4組細胞增殖抑制率高于實驗1組，實驗4組細胞增殖抑制率高于實驗2組；培養(yǎng)72 h時實驗2、3、4組細胞增殖抑制率高于實驗1組。上述結(jié)果提示，馬鈴薯提取液對HO-8910細胞有顯著的增殖抑制作用，并呈一定的時間劑量依賴性。

表2　各組細胞中磷酸化ERK1/2蛋白表達比較±s)

注：與同組培養(yǎng)0、10 min相比，*P<0.05；與同時點對照組相比，#P<0.05；與同時點實驗1、2、4組相比，△P<0.05。

目前已經(jīng)確定與細胞生長、發(fā)育、分化、凋亡等生理活動有關(guān)的主要信號通路有四條：ERK信號轉(zhuǎn)導通路、P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導通路、C-Jun氨基末端激酶(JNK)信號轉(zhuǎn)導通路、ERK5/大絲裂素活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導通路[2，11，12]。其中以ERK信號轉(zhuǎn)導通路和JNK信號轉(zhuǎn)導通路的相關(guān)研究最多也最為詳細。在真核細胞中，ERK通路是將細胞外信號傳遞到細胞核的主要通路，在細胞增殖、分化和凋亡過程中起到主要的調(diào)節(jié)作用[13～17]。ERK是傳遞絲裂原信號的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，主要通過外界刺激使其磷酸化而激活，從而參與細胞增殖、分化或細胞凋亡。有研究[18，19]表明，用ERK1/2抑制劑PD98059作用于肺腺癌A549細胞后，抑制ERK1/2活化，并顯著抑制生長因子介導的細胞遷移。在非小細胞肺癌中，ERK1/2表達上調(diào)，其磷酸化水平也明顯增高，ERK通路處于持續(xù)活化狀態(tài)。ERK1和ERK2是將信號從表面受體轉(zhuǎn)導至細胞核的關(guān)鍵蛋白，其相對分子量分別為44、42 kDa。本研究觀察了馬鈴薯提取液對人卵巢癌細胞中磷酸化ERK1/2蛋白表達的影響，結(jié)果顯示，培養(yǎng)20、40 min時實驗3組細胞中磷酸化ERK1/2蛋白相對表達量低于同組培養(yǎng)0、10 min時，培養(yǎng)20、40 min時實驗3組細胞中磷酸化ERK1/2蛋白相對表達量低于同時點實驗1、2、4組，提示馬鈴薯提取液作用后，卵巢癌細胞中磷酸化ERK1/2蛋白表達水平隨時間延長而降低，在作用20 min后變化明顯，推測馬鈴薯提取液對卵巢癌細胞的增殖抑制作用可能是通過下調(diào)磷酸化ERK1/2蛋白表達而實現(xiàn)的。

綜上所述，馬鈴薯提取液可抑制人卵巢癌細胞增殖，并下調(diào)細胞內(nèi)磷酸化ERK1/2蛋白表達水平。馬鈴薯提取物在抗腫瘤方面有著巨大的發(fā)展?jié)摿?，有望為卵巢癌的治療提供新的途徑?/p>

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楊麗敏(E-mail:yanglm18@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.009

R737.31

A

1002-266X(2016)19-0028-03

2015-12-18)