馬清，賈茹，張春艷，金欣，左向華，林平，徐建明，陳水平，陳建魁1,

(1 安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍307臨床學(xué)院，北京100071;2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院;3 賽特生物公司)

?

肝癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測及其應(yīng)用

馬清1，2，賈茹2，張春艷2，金欣2，左向華2，林平3，徐建明2，陳水平2，陳建魁1,2

(1 安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍307臨床學(xué)院，北京100071;2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院;3 賽特生物公司)

目的檢測肝癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)，探討CTC檢測在肝癌診斷和治療監(jiān)測中的應(yīng)用價值。方法選擇肝癌患者27例納入肝癌組，另選30例健康體檢者為對照組。采集兩組外周血，用差減富集技術(shù)富集CTC，熒光原位雜交技術(shù)選擇CTC；采用電化學(xué)發(fā)光法檢測兩組血清腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖類抗原199(CA199)。比較CTC、AFP、CEA、CA199檢測診斷肝癌的敏感性、特異性、約登指數(shù)。分析CTC檢測結(jié)果與索拉菲尼靶向治療效果的關(guān)系。結(jié)果肝癌組CTC陽性22例(81.5%)，對照組均未檢出CTC，兩組檢出率相比，P<0.05。肝癌患者中均檢出C亞群腫瘤細(xì)胞，肝膽管細(xì)胞癌患者檢出A、B、C亞群腫瘤細(xì)胞。所有CTC陽性患者外周血中均檢出多倍體CTC，以三倍體腫瘤細(xì)胞數(shù)量最多(59.8%)。肝癌組中，AFP陽性17例、CEA陽性10例、CA199陽性11例，對照組分別為2、1、0例。CTC檢測診斷肝癌的約登指數(shù)均高于三項腫瘤標(biāo)志物檢測(P均<0.05)。肝癌組中10例堅持服用索拉菲尼，8例治療過程中CTC數(shù)量未有明顯變化，療效評價為SD，2例治療前CTC總數(shù)較高患者(>15/7.5 mL)在索拉菲尼治療1個周期后有明顯下降(<5/7.5 mL)，但療效評價也為SD。結(jié)論利用差減富集技術(shù)可有效檢出肝癌患者外周血中的CTC。CTC檢測較常用腫瘤標(biāo)志物檢測在肝癌診斷方面更有優(yōu)勢，也有助于評估肝癌患者靶向治療的效果。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞；肝腫瘤；肝癌；腫瘤標(biāo)志物

目前肝癌的主要治療方式包括手術(shù)切除、經(jīng)皮消融、冷凍治療、經(jīng)皮肝動脈插管栓塞化療等[1]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)指從腫瘤原發(fā)或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞。CTC檢測有實時、無創(chuàng)、便捷等優(yōu)點，為監(jiān)測腫瘤發(fā)生發(fā)展情況提供了新的選擇[2]。2013年12月～2015年12月，我們應(yīng)用差減富集法結(jié)合熒光原位雜交技術(shù)檢測肝癌患者的CTC，并分析CTC檢測在肝癌診斷和治療監(jiān)測中的應(yīng)用效能，現(xiàn)報告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料肝癌患者27例(肝癌組)，男24例、女3例，年齡28～84歲，肝細(xì)胞癌24例、肝膽管細(xì)胞癌3例，TNM分期Ⅱ期4例、Ⅲ期11例、Ⅳ期12例，11例未行任何治療、2例行手術(shù)切除治療、11例接受過肝動脈化療栓塞術(shù)。另選30例健康志愿者為對照組，男20例、女10例，年齡31～57歲。兩組年齡、性別分布有可比性。

1.2CTC檢測及結(jié)果判定

1.2.1CTC檢測采集兩組外周血7.5 mL置于枸櫞酸鈉抗凝管，混勻，4 h內(nèi)進(jìn)行處理。采用差減富集技術(shù)，以特殊離心介質(zhì)快速去除血中紅細(xì)胞和血漿蛋白，通過耦聯(lián)抗人白細(xì)胞表面抗原組合群的免疫磁微粒去除外周血中的白細(xì)胞，從而最大程度地富集外周血中的腫瘤細(xì)胞。將免疫熒光染色與染色體原位雜交技術(shù)整合，使用CEP8探針雜交腫瘤細(xì)胞，有效區(qū)分CTC、富集未除盡的白細(xì)胞和非血源性腫瘤上皮細(xì)胞。

1.2.2結(jié)果判定外周血富集后細(xì)胞可分為五個亞群：CK+/CD45-/CEP8=2為A亞群(CK陽性的二倍體腫瘤細(xì)胞)，CK+/CD45-/CEP8≠2為B亞群(CK陽性的非二倍體腫瘤細(xì)胞)，CK-/CD45-/CEP8≠2為C亞群(CK陰性的非二倍體腫瘤細(xì)胞)，CK-/CD45-/CEP8=2為D亞群(非腫瘤上皮細(xì)胞或CD45未著色的白細(xì)胞)，CK-/CD45+/CEP8≠2為E亞群(白細(xì)胞)。A、B、C亞群判定為CTC。

1.3腫瘤標(biāo)志物檢測采集兩組靜脈血離心獲得血清，采用電化學(xué)發(fā)光法測定血清AFP、CEA、CA199，其中AFP>5.8 IU/mL為陽性、CEA>4.3 ng/mL為陽性、CA199>27.0 IU/mL為陽性。

1.4靶向治療方法及療效評價肝癌組所有患者均口服索拉菲尼400 mg/次，2次/d，每4周為一個治療周期。除肝癌針對性治療外，服藥過程中可接受其他對癥治療，包括針對藥物不良反應(yīng)的治療。所有患者每月門診隨訪時進(jìn)行腹部MRI檢查。療效評價參照實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)(RECIST)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。將患者血清AFP、CEA、CA199、CTC檢測結(jié)果輸入數(shù)據(jù)庫，計算血清AFP、CEA、CA199、CTC檢測在肝癌診斷中的靈敏性、特異性，以最大約登指數(shù)(靈敏性+特異性-1)評估診斷效能。本研究資料屬于偏態(tài)分布，定量資料采用秩和檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CTC檢出情況肝癌組CTC陽性22例(肝細(xì)胞癌患者19例、肝膽管細(xì)胞癌患者3例)、陰性5例，陽性率為81.5%；對照組未檢出CTC；兩組CTC檢出率相比，P<0.05。19例HCC患者均檢出C亞群，3例肝膽管細(xì)胞癌患者中1例檢出A亞群、1例檢出B亞群、3例檢出C亞群。所有CTC陽性患者外周血中均檢出多倍體CTC。在所有檢出的腫瘤細(xì)胞中，以三倍體腫瘤細(xì)胞數(shù)量最多(占CTC總數(shù)的59.8%)。

2.2CTC、腫瘤標(biāo)志物檢測診斷肝癌的效能比較肝癌組中，AFP陽性17例、CEA陽性10例、CA199陽性11例，對照組分別為2、1、0例。CTC檢測診斷肝癌的約登指數(shù)均高于三項腫瘤標(biāo)志物檢測(P均<0.05)。見表1。

2.3CTC檢測結(jié)果與靶向治療效果的關(guān)系肝癌組中10例服用索拉菲尼，8例治療中CTC數(shù)量未有明顯變化，療效評價為SD，2例治療前CTC總數(shù)較高者(>15/7.5 mL)在索拉菲尼治療1個周期后有明顯下降(<5/7.5 mL)，但療效評價也為SD。

3　討論

腫瘤細(xì)胞播散進(jìn)入血循環(huán)是發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的先決條件，在形成明顯的原發(fā)灶前，腫瘤細(xì)胞或已脫落入血。CTC檢測具有創(chuàng)傷性小、安全性高的優(yōu)點。但CTC在外周血中存在的數(shù)目極少，僅為白細(xì)胞數(shù)量的1/107～1/106。CTC在不斷適應(yīng)外周血微環(huán)境的過程中，一部分發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，一些腫瘤細(xì)胞可出現(xiàn)凋亡和抗原表達(dá)減弱。本研究采用免疫磁珠陰性分選技術(shù)，通過去除外周血中白細(xì)胞從而富集腫瘤細(xì)胞，然后進(jìn)一步通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色(CK18)結(jié)合原位雜交技術(shù)(FISH法)鑒定腫瘤細(xì)胞，使CTC得到最大程度的富集鑒定[3]。

表1　CTC、AFP、CEA、CA199測診斷肝癌的敏感性、特異性、約登指數(shù)比較(%)

在對腫瘤組織進(jìn)行免疫組化染色的過程中發(fā)現(xiàn)，正常組織中CK表達(dá)從靠近匯管區(qū)向肝小葉中央?yún)^(qū)呈逐漸衰減趨勢；而在肝癌組織中，癌細(xì)胞和間質(zhì)內(nèi)假膽管染色均呈陽性[4]。本研究中僅1例肝膽管細(xì)胞癌患者外周血中檢出CTC部分CK18染色陽性，19例肝細(xì)胞癌患者外周血中的CTC CK18染色均呈陰性。我們認(rèn)為，雖然CTC來源于原發(fā)灶，理論上可代表其細(xì)胞的異質(zhì)性，但在脫落入血過程中發(fā)生EMT后細(xì)胞表面標(biāo)志物可發(fā)生變化。

腫瘤細(xì)胞增殖能力強，有些細(xì)胞在化療后并不表現(xiàn)為凋亡，而是形成多倍體細(xì)胞。多倍體腫瘤細(xì)胞遺傳性狀不穩(wěn)定，對放化療不敏感，檢出多倍體亞克隆腫瘤細(xì)胞的患者預(yù)后更差[5,6]。本研究結(jié)果顯示，22例CTC陽性者均檢出了多倍體CTC，其中14例檢出3倍體亞群細(xì)胞，11例檢出4倍體亞群細(xì)胞，12例檢出5倍體及以上多倍體亞群細(xì)胞。

血清腫瘤標(biāo)志物檢測以創(chuàng)傷小、敏感性和特異性高、患者易接受而深受臨床醫(yī)生青睞。在肝癌腫瘤標(biāo)志物中，AFP具有高敏感性，是肝癌診斷的首選血清學(xué)指標(biāo)；CEA是一種廣譜腫瘤標(biāo)志物，用于消化系統(tǒng)腫瘤的診斷；CA199升高也多見于消化系統(tǒng)腫瘤。本研究結(jié)果顯示，肝癌組AFP陽性17例、CEA陽性10例、CA199陽性11例，對照組分別為2、1、0例。CTC檢測診斷肝癌的約登指數(shù)均高于三項腫瘤標(biāo)志物檢測，提示CTC在肝癌診斷中的應(yīng)用效能較好。

索拉菲尼是一種口服小分子靶向藥物，作用于Raf/MEK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的Raf激酶阻斷腫瘤細(xì)胞增殖[7]。本研究結(jié)果顯示，8例基線CTC<5/7.5 mL的患者在索拉菲尼治療過程中，CTC數(shù)量未明顯變化，但CTC總數(shù)始終<5/7.5 mL；2例治療前CTC總數(shù)>15/7.5 mL的患者，在索拉菲尼治療1個周期后外周血CTC總數(shù)降到5/7.5 mL以下，腫瘤病灶長徑也有所減小。上述結(jié)果提示檢測外周血CTC可能有助于評估靶向治療的效果。

研究[8,9]表明，CTC可預(yù)測多種腫瘤患者的無進(jìn)展生存期和總生存期，并與患者預(yù)后有一定關(guān)系。有學(xué)者[10]認(rèn)為CTC檢測對乳腺癌治療方案的選擇有一定指導(dǎo)作用[11]。然而，本研究入組病例數(shù)較少且觀察時間有限，若要得出明確結(jié)論，還需進(jìn)行大樣本的后續(xù)研究。

[1] 許赟.極早期肝癌的治療現(xiàn)狀[J].中國微創(chuàng)外科雜志，2015,15(8): 739-743.

[2] Mu Z,Wang C,Ye Z,et al.Prospective assessment of the prognostic value of circulating tumor cells and their clusters in patients with advanced-stage breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2015,154(3):563-571.

[3] Ge F,Zhang H,Wang DD,et al.Enhanced detection and comprehensive in situ phenotypic characterization of circulating and disseminatedheteroploid epithelial and glioma tumor cells[J].Oncotarget,2015,6(29):27049-27064.

[4] 李蔚,周慧聰,李繼昌,等.細(xì)胞角質(zhì)素CK18和CK19在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)[J].世界華人消化雜志,2008,16(7):721-725.

[5] Aly MS,Bahnassy AA,Abdel-Rahman ZN.Investigation of chromosomal aberrations in Egyptian hepatocellular carcinoma patients by fluorescence in situ hybridization[J].Indian J Hum Genet,2010,16(2):87-93.

[6] 王士勇,楊振君,于環(huán),等.多倍體腫瘤細(xì)胞的建立及其生物學(xué)特性的研究[J].中華腫瘤防治雜志,2008,15(12):886-889.

[7] Federico A,Orditura M,Cotticelli G,et al.Safety and efficacy of sorafenib in patients with advanced hepatocellular carcinoma and Child-Pugh A or B cirrhosis[J].Oncol Lett,2015,9(4):1628-1632.

[8] Jiang ZF,Cristofanilli M,Shao ZM,et al.Circulating tumor cells predict progression-free and overall survival in Chinese patients with metastatic breast cancer,HER2-positive or triple-negative (CBCSG004): a multicenter,double-blind,prospective trial[J].Ann Oncol,2013,24(11):2766-2772.

[9] Poveda A,Kaye SB,McCormack R,et al.Circulating tumor cells predict progression free survival and overall survival in patients with relapsed and recurrent advanced ovarian cancer[J].Gynecol Oncol,2011,122(3):567-572.

[10] Hayashi N,Nakamura S,Yagata H,et al.Chromosome 17 polysomy in circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a case series[J].Int J Clin Oncol,2011,16(5):596-600.

[11] Scher HI,Heller G,Molina A,et al.Circulating tumor cell biomarker panel as an individual-level surrogate for survival in metastatic castration-resistant prostate cancer[J].J Clin Oncol,2015,33(12):1348-1355.

Detection and application of circulating tumor cells in peripheral blood of patients with liver cancer

MA Qing1,JIA Ru,ZHANG Chunyan,JIN Xin,ZUO Xianghua,LIN Ping,XU Jianming,CHEN Shuiping,CHEN Jiankui

(1 PLA 307 Clinical College of Anhui Medical University,Beijing 100071,China)

ObjectiveTo observe the circulating tumor cells (CTC) in the peripheral blood of patients with liver cancer and to investigate the application of CTC detection in the early diagnosis and monitoring treatment of liver cancer.MethodsTwenty-seven patients with primary liver cancer were selected as the liver cancer group and 30 healthy person were selected as the control group.The peripheral blood was collected,and we enriched the CTC by subtraction enrichment technology and identified them by fluorescence in situ hybridization (FISH) technique.The serum tumor markers AFP,carcino-embryonic antigen (CEA) and CA199 of the two groups were detected by electrochemiluminescence method.The sensitivity,specificity and youden index of CTC,AFP,CEA and CA199 were comprehensively compared,and the relationship between CTC and therapeutic effect of targeted therapy was analyzed.ResultsCTC was detected in 22 cases of the liver cancer group,while in the control group the number was 0 (P<0.05).C subset of tumor cells was detected in 22 cases of the liver cancer group while there was only 1 case of A subset and 1 case of B subset.Polyploidy tumor cells were all detected in patients with positive CTC,and the triploid took the largest proportion (59.8%).In the liver cancer group,17 cases were positive AFP,10 cases were positive CEA and 11 cases were positive CA199,while the numbers in the control group were respectively 2,1 and 0.The youden index of CTC detection was better than the other three tumor markers in detection and diagnosis (P<0.05).Ten patients in the liver cancer group insisted taking target drugs,the number of CTC was stable in 8 patients,the RECIST was SD.The number of CTC declined (<5/7.5 mL) in 2 patients with high TCT number (>15/7.5 mL) after taking one-week Sorafenib,while the RECIST was also SD.ConclusionsCTC in the peripheral blood of patients with liver cancer could be detected effectively by subtraction enrichment technique.Compared with common tumor markers,the CTC detection shows more advantages,and it could be used to assess the effect of targeted therapy in patients with liver cancer.

circulating tumor cells; liver neoplasms; liver cancer; tumor biomakers

首都臨床特色應(yīng)用研究項目(Z121107005112001)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2011AA02A111)。

馬清(1990-)，女，碩士研究生，主要研究方向為免疫學(xué)。E-mail：395050029@qq.com

簡介：陳建魁(1963-)，男，主任醫(yī)師，主要研究方向為免疫學(xué)。E-mail：chenjk307@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.006

R735.7

A

1002-266X(2016)19-0019-03

2015-12-24)