郭曉玲　張海波　陳　文　江雪蓮（湖北省十堰市太和醫(yī)院 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

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燈盞細(xì)辛上調(diào)大鼠局灶性腦缺血再灌注后VEGF的實(shí)驗(yàn)研究*

郭曉玲張海波陳文江雪蓮△
（湖北省十堰市太和醫(yī)院 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

目的 研究燈盞細(xì)辛對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的影響，探討其對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。方法 SD大鼠30只，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及燈盞細(xì)辛組，采用線栓willis環(huán)的方法造模。治療用燈盞細(xì)辛尾靜脈給藥治療10 d，先測(cè)量治療前及第1、5、10日4個(gè)時(shí)點(diǎn)大鼠腦電圖病理性棘波（EEG）出現(xiàn)次數(shù)及局部腦血流量（rCBF），再采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)治療后缺血腦組織VEGF及VEGF受體Flk-1表達(dá)水平，并采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)VEGF-mRNA及Flk-1 mRNA表達(dá)，TTC染色觀察腦梗區(qū)細(xì)胞，比較腦梗死百分率。結(jié)果 與模型組比較，燈盞細(xì)辛組大鼠VEGF、Flk-1、VEGF mRNA及Flk-1F mRNA治療5 d后均上調(diào)，rCBF在第5、10日明顯增高，EEG明顯減少，腦梗死比例明顯縮小 （P<0.05）。結(jié)論 燈盞細(xì)辛可上調(diào)大鼠局灶性腦缺血再灌注后VEGF及VEGF受體Flk-1表達(dá)，這對(duì)減輕腦缺血再灌注后血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)程度、誘導(dǎo)缺血區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管新生、增加缺血區(qū)rCBF、縮小腦梗死區(qū)起到至關(guān)重要的作用，可明顯改善腦缺血再灌注損傷造成的血管內(nèi)皮功能紊亂。

大鼠燈盞細(xì)辛局灶性腦缺血血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體

【Abstract】Objective：To study Fleabane raising VEGF after focal cerebral ischemia and reperfusion in rats，and to explore the protective mechanism against cerebral ischemia reperfusion injury.Methods：30 SD rats were divided into the control group，the model group and fleabane group.Willis′circle was used to make models.Tail vein injection of Fleabane was given for 10 days.EEG and rCBF was detected before treatment and on 1st，5th and 10thday.ELISA was used to detect VEGF and Flk-1，RT-PCR for VEGF-mRNA and Flk-1mRNA.TTC was dyed to observe the cells of cerebral infarction；the percentage of cerebral infarction was compared.Results：Compared with the model group，VEGF，F(xiàn)lk-1，VEGF-mRNA and Flk-1FmRNA in fleabane group all rose 5 days after treatment；rCBF rose obviously on 5thand 10thday；EEG reduced obviously，as well as Cerebral infarction ratio（P<0.05）.Conclusion：Fleabane can raise VEGF and Flk-1after focal cerebral ischemia and reperfusion，which can reduce the extent of vascular endothelial inflammation after cerebral ischemia and reperfusion，induce ischemic vascular endothelial cell proliferation and angiogenesis，increase rCBF in the ischemic area，play a crucial role in reducing infarct area，and significantly improve endothelial dysfunction caused by cerebral ischemiareperfusion injury.

【Key words】Rats；Fleabane；Focal cerebral ischemia；Vascular endothelial growth factor；Receptor

急性腦梗死（ACI）發(fā)病急驟，常造成嚴(yán)重的傷殘后遺癥，病死率更高達(dá)30%以上，其病理改變主要是腦血管粥樣硬化斑塊脫落栓塞血管引起的急性血流障礙［1］，在使用溶栓藥或擴(kuò)管藥治療后，由于血液再通，常造成腦缺血再灌注損傷而加重病情，出現(xiàn)急性腦功能缺損而致殘，嚴(yán)重者常導(dǎo)致患者死亡，是臨床常見(jiàn)的嚴(yán)重威協(xié)人類(lèi)健康的腦血管意外。故其治療應(yīng)重點(diǎn)考慮血液再通后造成腦缺血再灌注損傷，近年來(lái)臨床嘗試用中藥制劑燈盞細(xì)辛取得了可靠療效，但其對(duì)治療機(jī)制特別是對(duì)ACI溶栓治療后血管內(nèi)皮再生的影響鮮有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)用燈盞細(xì)辛來(lái)干預(yù)大鼠局灶性腦缺血再灌注來(lái)觀察其對(duì)缺血腦組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及受體Flk-1表達(dá)水平的影響，以揭示其保護(hù)機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組SD大鼠30只，體質(zhì)量（200± 20）g，雄性，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK（鄂）2014-0008］，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、燈盞細(xì)辛組。用普通飼料喂養(yǎng)3組動(dòng)物（每日50 g/kg），自由飲水，每籠1只，保證動(dòng)物福利。

1.2藥品與器材燈盞細(xì)辛注射液（云南生物谷藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)Z53021620）；水合氯醛（上海展云化工有限公司，批號(hào)302-17-0）；BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟電子有限公司）。AUY120島津電子天平（北京京海佳業(yè)科貿(mào)有限公司，型號(hào)AUY120）；大鼠VEGF及FLK-1 ELISA試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司，批號(hào)GRDS13-110，RDS13-115）；大鼠提取VEGF mRNA及FLK-1 mRNA RT-PCR試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司，批號(hào)GRDS13-106，GRDS13-107）；消毒自制尼龍栓線。

1.3造模及治療方法按文獻(xiàn)［2］手術(shù)步驟，所有大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，不禁水，按2.5 mL/kg的用量腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后仰臥位固定在大鼠手術(shù)臺(tái)上，頸胸部消毒后切開(kāi)頸部皮膚，分離出入顱骨的翼腭動(dòng)脈并用動(dòng)脈夾夾閉之以防止栓線誤插入供應(yīng)面部的小動(dòng)脈，另一動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈，頸總動(dòng)脈分頸外和頸內(nèi)動(dòng)脈2個(gè)分支，用眼科剪在頸內(nèi)動(dòng)脈剪一V形小口，將自制尼龍栓線插入18 mm或有阻力感為止（此時(shí)栓線已進(jìn)入Willis環(huán)并阻斷供血），阻斷血流60 min后抽出絲線復(fù)灌，縫合并消毒手術(shù)創(chuàng)口。觀察大鼠行為，當(dāng)出現(xiàn)下例情況之一者可作為造模成功標(biāo)準(zhǔn)：1）大鼠左前爪內(nèi)收，或因前爪內(nèi)收造成步態(tài)不穩(wěn)；2）提起大鼠尾巴，懸空時(shí)左前爪不能伸展，左側(cè)前爪內(nèi)收，行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈。對(duì)照組10只大鼠手術(shù)步驟同上但不插入栓線阻斷血流作為對(duì)照。造模成功后燈盞細(xì)辛組按10 mg/kg的用量將燈盞細(xì)辛注射液從尾靜脈注射給藥，每日1次，對(duì)照組及模型組尾靜脈注射1 mL 0.9%氯化鈉注射液，3組都治療10 d。

1.4大鼠腦梗死百分率在治療10 d時(shí)，從3組大鼠中取5只，斷頭處死動(dòng)物，迅速分離全部腦組織，濾紙吸干組織液，稱(chēng)重后編號(hào)，-20℃低溫冰箱冰凍30 min，然后取出，用切片機(jī)以冠狀面切成厚2 mm的腦薄片，37℃的1%TTC溶液避光染色，30 min后用4%的多聚甲醛固定。高倍顯微鏡下觀察腦薄片，腦薄片梗死區(qū)經(jīng)TTC染色后著色會(huì)加深，小心剝離出著色梗死部分稱(chēng)重并計(jì)算腦梗死百分率，腦梗死百分率（%）=（梗死質(zhì)量/總質(zhì)量）×100%。

1.4大鼠基因檢測(cè)方法用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄治療前后EEG，用記錄治療前后RCBF。按文獻(xiàn)方法［3］，在治療10 d從3組大鼠中取另5只，斷頭處死動(dòng)物，分離腦組織編號(hào)后至-7O℃低溫冰箱，采用酶聯(lián)免疫吸附法 （ELISA）檢測(cè)治療前后缺血腦組織VEGF及其受體Flk-1表達(dá)水平。VEGF及VEGF受體Flk-1檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)［4］，取低溫冰箱暫存的腦組織標(biāo)本1/2，研磨后放入勻漿器中勻漿，3000 r/min離心30 min，嚴(yán)格按VEGF及其受體Flk-1的ELISA試劑盒說(shuō)明操作，酶標(biāo)儀讀數(shù)取 VEGF及VEGF受體Flk-1表達(dá)值。采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)VEGF-mRNA及Flk-1mRNA表達(dá)OD值。檢測(cè)時(shí)先對(duì)標(biāo)本進(jìn)行RNA提取，RT-PCR引物設(shè)計(jì)如下。FIK-1 mRNA上游引物：F 5'-TTAGGGGTGGGGTGGG G-3'。下游引物：R 5'-CTACTCCACTACCAAG-3。VEGF上游引物：F 5'GCGAAGCGAATTTCCAACAGA CG-3'。下游引物：R 5'GCGGTCGACATAGAGCTTGT AGGA-3'。VEGF-mRNA及Flk-1mRNA用上述引物擴(kuò)增DNA片段。設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，35個(gè)循。PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，以DNAMarker標(biāo)記確定條帶大小，經(jīng)全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描攝像以確定灰度比值（OD值）。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)以（±s）表示，符合正態(tài)分布，方差齊時(shí)采用t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用校正t檢驗(yàn)。治療前及第1、5、10日4個(gè)時(shí)點(diǎn)大鼠EEG及rCBF采用重復(fù)測(cè)量方差分析，梗死比例以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠腦梗死百分率比較見(jiàn)表1。治療10 d病理圖片顯示，對(duì)照組著色均勻，神經(jīng)纖維無(wú)壞死溶解，細(xì)胞排列整齊。模型組梗死區(qū)著色加深，神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，有一部分已溶解，病理圖片顯示出現(xiàn)明顯壞死灶，梗死百分率為30.07%。燈盞細(xì)辛組有少量著色加深區(qū)，有極少部分的腦組織神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞溶合，細(xì)胞排列整齊，腦梗百分率16.93%，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示燈盞細(xì)辛具有擴(kuò)張梗死區(qū)微動(dòng)脈、減少梗死百分率的作用。

表1　各組大鼠腦梗死百分率比較（±s）

表1　各組大鼠腦梗死百分率比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組比較，△P＜0.05。下同。

組別　　正常（g）　　梗死百分率（%）對(duì)照組　0.121±0.014　0.00 n　　梗死（g）5　0.000±0.000模型組　0.085±0.016△　30.07*5　0.037±0.014△燈盞細(xì)辛組　5　0.021±0.012*0.104±0.008*　16.93*

2.2各組大鼠基因指標(biāo)比較見(jiàn)表2。模型組VEGF、VEGF mRNA、FLK-1、FLK-1 mRNA明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。燈盞細(xì)辛組VEGF、VEGF mRNA、FLK-1、FLK-1 mRNA明顯增強(qiáng)，與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示燈盞細(xì)辛能夠促進(jìn)缺血區(qū)組織VEGF的表達(dá)，改善缺血部位腦組織血管新生。

表2　各組大鼠基因指標(biāo)比較（±s）

表2　各組大鼠基因指標(biāo)比較（±s）

組　別　n VEGF（ng/mL）VEGF mRNA（pg/mL）FLK-1（ng/mL）FLK-1 mRNA（pg/mL）對(duì)照組　5模型組　5 4.78±0.13　0.82±0.09　2.58±0.07　0.69±0.05 2.59±0.05△　0.60±0.10△　1.07±0.11△　0.27±0.09△燈盞細(xì)辛組　57.79±0.24*　1.74±0.13*　4.49±0.16*　2.82±0.12*

2.3各組大鼠腦缺血再灌注后EEG及rCBF的比較見(jiàn)表3。BL-420L生物信號(hào)采集記錄顯示，模型組大鼠腦缺血再灌注后第1、5、10日EEG明顯增多，rCBF降低，與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這說(shuō)明腦缺血再灌注后損傷嚴(yán)重。燈盞細(xì)辛組第5、10日EEG明顯減少，rCBF增多，與模型組相比，經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差結(jié)果顯示球形假設(shè)檢驗(yàn)P＜0.05，故不服從球形假設(shè)，因此F=152.87，P＜0.05；多變量檢驗(yàn)結(jié)果中時(shí)間和分組交互作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明燈盞細(xì)辛能顯著降低大鼠腦缺血再灌注后抑制缺血異常，故腦電圖中異位棘波出現(xiàn)次數(shù)，改善微循環(huán)增加腦血流量的作用。

表3　各組大鼠腦缺血再灌注后EEG及rCBF比較（±s）

表3　各組大鼠腦缺血再灌注后EEG及rCBF比較（±s）

組 別　　時(shí) 間　EEG（Times/min）（rCBF=mL/100 g·min）對(duì)照組　　治療前　0.02±0.01　54.92±6.32 （n=5）　1 d　0.00±0.00　59.21±7.85 5 d　0.01±0.01　55.78±2.0 10 d　0.00±0.00　54.71±2.49模型組　　治療前　69.23±7.16△　23.35±4.90△（n=5）　1 d　70.12±8.32△　25.91±4.02△5 d　61.82±6.21△　21.32±1.57△10 d　66.74±6.72△　23.54±3.37△燈盞細(xì)辛組　治療前　67.81±7.21△　25.71±3.38△（n=5）　1 d　70.21±7.87△　27.02±3.07△5 d　31.37±5.30*△　33.27±4.97*△10 d　12.54±3.25*△　42.51±4.77*△

3　討　論

ACI的臨床癥狀和預(yù)后有賴(lài)于缺血區(qū)動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)的重建，因此，積極尋找具有促進(jìn)缺血血管新生的藥物對(duì)缺血性疾病治療具有重大意義。燈盞細(xì)辛中藥名燈盞花，富含燈盞花乙素、總黃酮、總咖啡酸酯、總咖啡酸酯、野黃芩苷、高黃芩素、二咖啡酰、奎寧酸酯等［5］。藥用菊科植物短葶飛蓬之全草，性溫、味辛甘，具有消積止痛、活血化瘀之效。燈盞細(xì)辛注射液是燈盞細(xì)辛全草現(xiàn)代工藝提取的酚酸類(lèi)滅菌注射液，主要有效成分燈盞花乙素、總黃酮、總咖啡酸酯及野黃芩苷，具有激活纖溶酶的活性及擴(kuò)張血管的作用，還具有抗凝、溶栓、清除自由基、抑制炎癥因子釋放及機(jī)體脂質(zhì)過(guò)度氧化的藥理效應(yīng)［6］，臨床主要用于治療缺血性中風(fēng)、冠心病心絞痛等。

血管內(nèi)皮功能的完整性取決于機(jī)體氧自由基的生成與清除，一般情況下，氧自由基的生成與清除保持動(dòng)態(tài)平衡，血管內(nèi)皮功能保持正常。當(dāng)血管狹窄或栓塞，特別是ACI時(shí)，腦組織局部血管急性血流障礙造成急性缺血缺氧，ATP供應(yīng)不足，細(xì)胞Na-K+-ATP大量釋放，Ca2+內(nèi)流并有可能造成鈣超載，細(xì)胞內(nèi)鈣超載會(huì)破壞線粒體結(jié)構(gòu)及功能，進(jìn)一步導(dǎo)致能量代謝紊亂，機(jī)體氧自由基、白細(xì)胞介素-2及前列腺素也大量產(chǎn)生，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞受損嚴(yán)重［7］。VEGF具有增加微、小靜脈血管的通透性、促使血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖及誘導(dǎo)血管生成再生等作用［8］。VEGF又分B、C、D等亞型，對(duì)缺血后血管內(nèi)皮再生都有相似的作用［9］。VEGF的受體Flk-1在損傷組織上會(huì)大量表達(dá)，其增多說(shuō)明VEGF的活性增強(qiáng)。

在本實(shí)驗(yàn)中，模型組VEGF及FLK-1、VEGF mRNA及FLK-1 mRNA表達(dá)均有不同程度的下降，大鼠腦缺血再灌注后EEG增多，rCBF急劇下降的，說(shuō)明缺血再灌注造成了嚴(yán)重?fù)p傷，且是不可逆的。模型組梗死百分率高達(dá)30.07%，燈盞細(xì)辛組TTC染色顯示有少量著色加深區(qū)，有極少部分的腦組織神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞溶合，細(xì)胞排列整齊，腦梗百分率16.93%，提示燈盞細(xì)辛具有擴(kuò)張梗死區(qū)微動(dòng)脈、減少梗死百分率的作用。燈盞細(xì)辛組VEGF及FLK-1、VEGF mRNA及FLK-1 mRNA在治療后表達(dá)均明顯上調(diào)，說(shuō)明燈盞細(xì)辛可增加FLK-1的數(shù)量，使VEGF表達(dá)上調(diào)，這對(duì)誘導(dǎo)缺血腦組織血管新生，促進(jìn)受損血管內(nèi)皮修復(fù)具有肯定作用。其機(jī)制可能與燈盞細(xì)辛活血化瘀的藥理作用有關(guān)，一方面可能抑制ATP酶過(guò)多釋放，降低細(xì)胞內(nèi)鈣超載的可能，也可能通過(guò)Na-K+-ATP酶調(diào)節(jié)Na+-H+交換來(lái)抑制Na+-Ca2+交換，經(jīng)阻止過(guò)多的Ca2+內(nèi)流來(lái)改善缺血腦組織能量代謝［10］。由于VEGF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有特異性的促有絲分裂作用［11］，可促進(jìn)缺血腦組織內(nèi)血管分化和生成，這對(duì)側(cè)支循環(huán)血管重塑和建立具有重要意義［12］。實(shí)驗(yàn)表明，燈盞細(xì)辛具有增加VEGF的受體 FLK-1表達(dá)作用，F(xiàn)LK-1增多進(jìn)一步。促進(jìn)VEGF的合成與分秘增加，促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷后血管內(nèi)皮再生，進(jìn)而促使血管重塑而達(dá)到維持血管的完整性的目的；另一方面，燈盞細(xì)辛擴(kuò)張腦血管，抑制炎性介質(zhì)的形成或釋放，防止缺血腦神經(jīng)元損傷，改善神經(jīng)細(xì)胞功能，還可使機(jī)體內(nèi)排膚類(lèi)被激活，清除局部組織的五羥色胺等致敏原，降低神經(jīng)興奮性，消除異常放電（實(shí)驗(yàn)中EEG減少），增加rCBF，改善微循環(huán)，增加腦組織供氧有關(guān)。在ACI時(shí)，腦組織供血供氧有賴(lài)于缺血側(cè)支循環(huán)的形成，這可以減輕腦組織的缺血缺氧現(xiàn)象，避免腦組織缺血壞死，改善血液再通后造成腦缺血再灌注損傷后的臨床癥狀。總之，注射燈盞細(xì)辛可起擴(kuò)張局部微血管，增加組織灌注，改善局部血液循環(huán)，消除局部炎癥，達(dá)到活血化瘀、止痛消積之功效［13］。但缺血再灌注損傷有多因素參與的復(fù)雜代謝過(guò)程，燈盞細(xì)辛如何在各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮調(diào)節(jié)及干預(yù)、阻斷缺血/再灌注損傷的發(fā)生，還有待深入研究。

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Research of Fleabane Raising VEGF after Focal Cerebral Ischemia and Reperfusion in Rats

GUO Xiaoling，ZHANG Haibo，CHEN Wen，et al. Orthopedics Department，Taihe Hospital of Shiyan，Hubei Medical College Affiliated Hospital，Hubei，Shiyan 442000，China.

R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

1004-745X（2016）06-0985-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.012

湖北省教育廳科研項(xiàng)目（15D081）

△（電子郵箱：guoxiaolingxl@126.com）

（2016-01-30）