汪?；邸￠Z國(guó)良△　熊旭東（.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海 0007；.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 000）

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抗炎合劑對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠血清可溶性CD80、CD86、TNF-α、IL-10水平的影響*

汪?；?閆國(guó)良1△熊旭東2
（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021）

目的 觀察抗炎合劑對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠血清可溶性CD80、CD86水平的影響。方法 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、抗炎合劑組、清開靈組。采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）制備膿毒癥急性肺損傷模型，分別于造模后24 h處死動(dòng)物，并進(jìn)行肺組織HE染色，測(cè)定大鼠血清可溶性CD80、CD86及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）含量。結(jié)果 模型組大鼠CD80、CD86含量較假手術(shù)組明顯增高（P<0.01），抗炎合劑組CD80、CD86含量較模型組明顯降低（P<0.01）。抗炎合劑組CD80含量低于清開靈組（P<0.01），CD86與清開靈組差異不明顯（P>0.05）。模型組大鼠血清TNF-α、IL-10含量較假手術(shù)組明顯增高（P<0.01）；抗炎合劑組TNF-α、IL-10較模型組明顯降低（P<0.01），而TNF-α/IL-10（Th1/Th2）比值則高于模型組（P<0.05）；清開靈組IL-10值高于抗炎合劑組（P<0.01），而TNF-α及TNF-α/IL-10與抗炎合劑組無(wú)明顯差異（P>0.05）。結(jié)論 抗炎合劑可通過(guò)減少CD80、CD86的表達(dá)減少炎癥因子釋放，從而有效減輕大鼠的肺損傷程度。

抗炎合劑膿毒癥急性肺損傷可溶性CD80可溶性CD86

【Abstract】Objective：To observe the influence of anti-inflammatory decoction on soluble CD80（sCD80），and soluble CD86（sCD86）in serum of rats with acute lung injury induced by sepsis.Methods：Male clean SD rats were randomly divided into sham operation group，the model group，anti-inflammatory group，Qingkailing group. Models with acute lung injury induced by sepsis were reproduced in rats with cecal ligation and puncture（CLP）. Each rat was tested 24h after CLP.Histopathological sections of the lung tissues of the rats were stained by HE for observation of histopathological changes.The content of sCD80，sCD86，TNF-α and IL-10 of the serum of the rats were also measured for the observation of inflammation.Results：Compared with sham operation group，there was significant increase in the content of sCD80，sCD86，TNF-α and IL-10 in the serum of the model group.On the other side，compared with the model group，the content of sCD80，sCD86，TNF-α，and IL-10 in the serum of Anti-inflammatory group and Qingkailing group decreased，especially in the Anti-inflammatory group.Conclusion：Anti-inflammatory can effectively decrease the inflammation by decreasing the expression of sCD80 and sCD86 to reduce the production of TNF-α and IL-10 in rats with acute lung injury induced by sepsis.

【Key words】Anti-inflammatory；Sepsis；Acute lung injury；Soluble CD80；Soluble CD86

膿毒癥（Sepsis）是由細(xì)菌感染所致的全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）。急性肺損傷（ALI）是各種原因造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，而導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全。引起ALI的原因中，膿毒癥被認(rèn)為是最主要的高風(fēng)險(xiǎn)因素［1］。目前機(jī)體內(nèi)促炎、抗炎的失衡被視為膿毒癥的主要發(fā)病機(jī)制之一，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）介導(dǎo)的輔助性T細(xì)胞（Th1）/Th2的漂移被認(rèn)為是炎癥平衡失調(diào)的主要原因［2］。CD80、CD86是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的2個(gè)參與T細(xì)胞活化的協(xié)同刺激分子，具有參與調(diào)節(jié)Treg的功能［3］，并為參與肺系疾病發(fā)病機(jī)制中的重要因子［4］。目前Th在膿毒癥進(jìn)展過(guò)程中的作用越來(lái)越受到學(xué)者們的關(guān)注，而CD80、CD86與膿毒癥肺損傷的相關(guān)性研究報(bào)道相對(duì)較少。本課題組在大量臨床實(shí)踐的基礎(chǔ)上，創(chuàng)立中藥復(fù)方“抗炎合劑”并證實(shí)其可有效減輕膿毒癥患者的炎癥反應(yīng)［5］。綜上，本研究擬通過(guò)制備膿毒癥急性肺損傷大鼠模型，探索膿毒癥急性肺損傷大鼠血清可溶性CD80（sCD80）、CD86 （sCD86）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-10 （IL-10）的變化，以及中藥抗炎合劑對(duì)其的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物健康雄性SD大鼠，40只，清潔級(jí)，體質(zhì)量200～220 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)SYXK（滬）2014-0019，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心清潔級(jí)動(dòng)物房，室溫23℃，濕度50%，12 h照明，動(dòng)物自由進(jìn)食飲水。

1.2藥物與試劑抗炎合劑由生大黃、黃芩、敗醬草、厚樸、黃連組成，所有藥物均為符合2010版《中國(guó)藥典》規(guī)定并加工炮制合格的飲片，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，并由制劑中心制備成含生藥1.0 g/mL的棕色透明液體，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。清開靈膠囊規(guī)格：每粒0.4 g（含黃芩甙20 mg），購(gòu)自神威藥業(yè)集團(tuán)，批號(hào)14060111。

1.3分組與造模采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）制備膿毒癥急性肺損傷大鼠模型［6］：大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，以腹正中作一1.5 cm長(zhǎng)的切口，找到盲腸，在其根部結(jié)扎，用5 mL注射器針頭穿通3次，輕擠出少量腸內(nèi)容物，留置2 mm皮瓣防止針孔閉合，還納盲腸于腹腔，逐層縫合腹壁切口，術(shù)畢皮下注射0.9%氯化鈉注射液抗休克。大鼠隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組、模型組、抗炎合劑組、清開靈組，每組各10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。假手術(shù)組以生理鹽水灌胃3 d后行假手術(shù)（經(jīng)麻醉后開腹，輕輕翻動(dòng)腸道后關(guān)腹），術(shù)后24 h麻醉并腹主動(dòng)脈采血致死；模型組、抗炎合劑組、清開靈組分別以0.9%氯化鈉注射液、抗炎合劑、清開靈灌胃3 d （9.9 g/kg）后行CLP術(shù)，術(shù)后24 h麻醉并腹主動(dòng)脈采血致死。

1.4標(biāo)本采集與檢測(cè)以10%水合氯醛（0.5 mL/100 g）大鼠腹腔注射麻醉，開腹后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，4℃靜置2 h后，3000 r/min，10 min，4℃離心，吸取上清，分裝，按照sCD80、sCD86、TNF-α、IL-10ELISA試劑盒 （購(gòu)自上海富勒生物科技有限公司）說(shuō)明書的方法操作，在450 nm處測(cè)吸光度，并以TNF-α/IL-10比值作為Th1/Th2。沿大鼠左右肋軟骨迅速打開胸腔，快速取出左右肺，冰上切取左、右肺組織。取右肺用冰0.9%氯化鈉注射液沖洗表面，取1/3右肺組織標(biāo)本用于HE染色，余肺組織-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1一般情況假手術(shù)組大鼠形態(tài)、進(jìn)食、呼吸狀況、活動(dòng)量無(wú)明顯異常，大便正常；模型組大鼠術(shù)后精神萎軟，體毛豎立、凌亂，活動(dòng)減少，多呈蜷縮狀，眼鼻處分泌物多，不欲進(jìn)食，呼吸急促，腹部膨隆，無(wú)大便；抗炎合劑組與清開靈組大鼠術(shù)后精神狀況、活動(dòng)量及眼鼻分泌物好于模型組。

2.2肺組織病理染色見圖1。假手術(shù)組肺組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔內(nèi)清晰，間質(zhì)無(wú)明顯水腫、炎癥等病理改變；模型組可見肺間質(zhì)水腫明顯，炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)，肺泡明顯減少，肺組織實(shí)變明顯；抗炎合劑及清開靈組與模型組相比，損傷范圍較小，肺泡量較多，肺間質(zhì)水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)相比模型組較好，肺實(shí)變較輕。見圖1。

圖1　各組大鼠肺組織（HE染色，×100）

2.3各組血清可溶性CD80含量的比較見表1。模型組大鼠CD80含量較假手術(shù)組明顯增高 （P<0.01），抗炎合劑組CD80含量較模型組明顯降低 （P<0.01），并且CD80含量低于清開靈組（P<0.01）。

表1　各組大鼠CD80、CD86表達(dá)結(jié)果比較（±s）

表1　各組大鼠CD80、CD86表達(dá)結(jié)果比較（±s）

與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與抗炎合劑組比較，##P＜0.01。下同。

組　別　n　CD80（pg/mL）　CD86（ng/mL）假手術(shù)組　10　18.284±1.990　4.122±0.463模型組　10　49.523±2.717**　6.530±0.258**抗炎合劑組　10　28.908±0.687△△　3.747±0.194△△清開靈組　10　44.529±2.877##　4.845±0.400

2.4各組血清可溶性CD86含量的比較見表1。與假手術(shù)相比，模型組大鼠CD86含量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；抗炎合劑組CD86含量較模型組明顯降低（P<0.01），而與清開靈組差異不明顯。

2.5各組血清TNF-α、IL-10含量的比較見表2。模型組大鼠血清TNF-α、IL-10含量較假手術(shù)組明顯增高（P<0.01）；抗炎合劑組TNF-α、IL-10較模型組明顯降低（P<0.01），而TNF-α/IL-10（Th1/Th2）比值則高于模型組（P<0.05）；清開靈組IL-10值高于抗炎合劑組（P<0.01），而TNF-α及TNF-α/IL-10與抗炎合劑組無(wú)明顯差異（P>0.05）。

表2　各組大鼠TNF-α、IL-10含量及TNF-α/IL-10比值測(cè)定（±s）

表2　各組大鼠TNF-α、IL-10含量及TNF-α/IL-10比值測(cè)定（±s）

組　別　n　TNF-α（ng/L）IL-10（ng/L）　TNF-α/IL-10假手術(shù)組　10　48.621±7.894模型組　10　146.516±5.869**抗炎合劑組　10　75.668±4.979△△11.896±0.207　4.112±0.391 113.759±1.031**　1.721±0.275**24.892±0.666△△　3.694±0.142△清開靈組　10　79.051±4.99835.439±0.358##　2.455±0.339

3　討　論

膿毒癥屬中醫(yī)學(xué)“溫病”“熱病”范疇，而膿毒癥急性肺損傷則屬于“喘證”“暴喘”“喘脫”范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肺失宣降是ALI發(fā)生的病理基礎(chǔ)，痰熱瘀閉是ALI發(fā)展的病機(jī)，肺不主氣是ALI轉(zhuǎn)危之病理關(guān)鍵，而肺與大腸相表里，肺熱葉焦、功能失調(diào)，腸道津虧，毒邪聚集腸中，久則熱毒互結(jié)，內(nèi)陷營(yíng)血，內(nèi)損臟腑脈絡(luò)，氣血失和，整體功能失調(diào)?；诖耍P者采取清熱通腑、活血排毒之法，創(chuàng)立抗炎合劑，方中大黃為君，瀉下攻積、清熱瀉火、活血祛瘀，黃芩、黃連為臣，清熱燥濕，瀉火解毒，厚樸、敗醬草為佐，行氣、平喘、消癰排膿，全方共奏苦寒并用以清熱，通腑活血以排毒之功。在前期臨床試驗(yàn)中，此方聯(lián)合西醫(yī)治療熱毒互結(jié)、腑氣不通及脈絡(luò)瘀滯的膿毒癥急性肺損傷患者在改善癥狀及減輕炎癥反應(yīng)方面取得了較好的療效［7-9］。

CD80、CD86屬于免疫球蛋白超家族成員，分別于1989、1993年由Freeman首次發(fā)現(xiàn)并克隆成功，并在第5屆白細(xì)胞分化抗原大會(huì)正式命名。CD80、CD86是2個(gè)提供協(xié)同刺激信號(hào)的重要分子。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)CD80、CD86與CD28結(jié)合后可導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)NF-κB和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生［10］，并使免疫應(yīng)答向Th1和Th2分化，其中CD80主要刺激CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，而CD86則共刺激CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化［3］，這在介導(dǎo)肺部炎癥及氣道反應(yīng)上起著重要的作用［11］。膿毒癥ALI的本質(zhì)是機(jī)體炎癥反應(yīng)的失控，而促炎反應(yīng)和抗炎反應(yīng)失衡是炎癥反應(yīng)失控的主要表現(xiàn)。T輔助淋巴細(xì)胞Th1/Th2的功能能夠反映機(jī)體促炎和抗炎反應(yīng)的失衡情況。Th1細(xì)胞以分泌干擾素-γ（IFN-γ）、TNF-α、IL-2等促炎細(xì)胞因子為主，Th2細(xì)胞以分泌IL-10、IL-4、IL-5等抗炎細(xì)胞因子為主［12］。機(jī)體正常時(shí)，Th1和Th2細(xì)胞功能處于動(dòng)態(tài)平衡中，維持機(jī)體正常的細(xì)胞免疫和體液免疫。在膿毒癥感染過(guò)程中，機(jī)體啟動(dòng)致炎反應(yīng)的同時(shí)也啟動(dòng)了抗炎反應(yīng)，感染早期表現(xiàn)為以炎性反應(yīng)為主的Th1反應(yīng)，晚期則表現(xiàn)為抗炎反應(yīng)為主的Th2反應(yīng)，或表現(xiàn)為混合反應(yīng)，而促炎介質(zhì)的增多與膿毒癥的病死率增加有關(guān)，抗炎介質(zhì)增加也預(yù)示著膿毒癥的病情嚴(yán)重程度及預(yù)后不良［13-15］。

本項(xiàng)研究中模型組大鼠血清可溶性CD80、CD86、TNF-α、IL-10較假手術(shù)組均明顯上升，而抗炎合劑組該組指標(biāo)則明顯下降，且TNF-α/IL-10較模型組增高。據(jù)此筆者推斷抗炎合劑可能通過(guò)減少膿毒癥ALI大鼠CD80、CD86表達(dá)，抑制IL-10、TNF-α等細(xì)胞因子的釋放，減少Th1向Th2漂移，從而減輕肺組織炎癥反應(yīng)，其可作為治療膿毒癥ALI的一個(gè)方向，進(jìn)一步深入研究。

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Effect of Anti-inflammatory Decoction on Soluble CD80 and Soluble CD86 in Serum of Rats with Acute Lung Injury Induced by Sepsis

WANG Haihui，YAN Guoliang，XIONG Xudong. Shanghai Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Shanghai University of T.C.M.，Shanghai 200071，China.

R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

1004-745X（2016）06-0981-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.011

上海市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目（20124068）

△（電子郵箱：7120@szy.sh.cn）

（2016-02-20）