李　亮　彭　輝　孫立峰　田延冰　孟劍鋒　謝蘭蘭（河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院，河北 邢臺(tái) 054031）

?

銀杏內(nèi)酯B對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響*

李亮△彭輝孫立峰田延冰孟劍鋒謝蘭蘭
（河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院，河北 邢臺(tái) 054031）

目的 觀察銀杏內(nèi)酯B（GB）對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。方法 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為 5組：對(duì)照組、H2O2（200 μmol/L）干預(yù)組、GB（50、100和 200 μmol/L）+H2O2（200 μmol/L）干預(yù)組，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔。經(jīng)藥物干預(yù)16 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；測(cè)定培養(yǎng)液中心肌酶（AST、CPK、LDH）活性；檢測(cè)細(xì)胞中超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量；通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀況并計(jì)算凋亡率，采用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中AKT mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)，計(jì)算Bcl-2/Bax表達(dá)比值，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞核因子-κB（NF-κB）蛋白表達(dá)并進(jìn)行半定量分析，比色法檢測(cè)細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9活性。結(jié)果 與H2O2干預(yù)組比較，GB（100、200 μmol/L）+H2O2（200 μmol/L）干預(yù)組細(xì)胞存活率顯著升高（P<0.01），培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH活性顯著降低（P<0.05或P<0.01），細(xì)胞中SOD、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低（P<0.05或P<0.01）；GB干預(yù)組細(xì)胞凋亡狀況明顯好轉(zhuǎn)，其中GB（100、200 μmol/L）+H2O2（200 μmol/L）干預(yù)組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P< 0.01），AKT mRNA和bcl-2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05或P<0.01），Bax mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01），Bcl-2/Bax表達(dá)比值顯著升高（P<0.01），細(xì)胞中NF-kB蛋白表達(dá)量和Caspase-3、Caspase-9活性顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論 GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用；其作用機(jī)制可能與GB能夠有效改善抗氧化酶活性、降低氧化應(yīng)激損傷，下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)，上調(diào)抗凋亡基因AKT和bcl-2表達(dá)、下調(diào)促凋亡基因Bax表達(dá)，提高Bcl-2/Bax表達(dá)比值，降低Caspase-3、Caspase-9活性有關(guān)。

銀杏內(nèi)酯BH9C2心肌細(xì)胞過(guò)氧化氫凋亡機(jī)制

【Abstract】Objective：To investigate the effects and mechanism of Ginkgolide B（GB）on apoptosis of H9C2 cardiomyocytes induced by H2O2.Methods：H9C2 cardiomyocytes in logarithmic phase were randomly divided into the normal control group，H2O2group，GB（50，100，200 μg/mL）+H2O2groups（n=10）.Sixteen hours after the drugs were given，the survival rate was detected with MTT；the activity of AST，CPK and LDH in culture medium were detected；the activity of SOD，CAT and the content of MDA in cardiomyocytes were determinted；the cardiomyocytes apoptosis was observed with flow cytometry and the apoptosis rate was calculated；the expression of AKT mRNA，bcl-2 mRNA and Bax mRNA were detected with RT-PCR，and the ratio of bcl-2/Bax was calculated；the expression of NF-kB proten was detected with Western blot and Semi-quantitatively analysized；the activity of caspase-3 and caspase-9 were determined.Results：Compared with the H2O2group，the survival rate in GB （100，200 μg/mL）+H2O2groups significantly increased（P<0.01）；the activity of AST，CPK and LDH in culture medium significantly decreased（P<0.05 or P<0.01）；the activity of SOD and CAT in cardiomyocytes significantly increased and the content of MDA significantly decreased（P<0.05 or P<0.01）；the cardiomyocytes apoptosis were improved and the apoptosis rate significantly decreased（P<0.01）；the expression of AKT mRNA and bcl-2 mRNA was significantly up-regulated，while the expression of Bax mRNA was significantly down-regulated；the ratio of bcl-2/Bax significantly increased（P<0.01）；and the expression of NF-kB significantly down-regulated（P< 0.05 or P<0.01）；the activity of caspase-3 and caspase-9 significantly decreased（P<0.05 or P<0.01）.Conclu-sion：GB has inhibitive effects on apoptosis of H9C2 cardiomyocytes induced by H2O2，which is perhaps related to its effects of improving the activity of antioxidase，depressing oxidative stress，down-regulating the expression of NF-kB proten，up-regulating the expression of anti-apoptotic genes AKT and bcl-2，down-regulating the expression of pro-apoptotic genes Bax，raising the ratio of bcl-2/Bax，and lowering the activity of caspase-3 and caspase-9.

【Key words】Ginkgolide B；H9C2 cardiomyocytes；H2O2；Apoptosis；Mechanism

研究發(fā)現(xiàn)，萜內(nèi)酯類化合物為銀杏葉的主要有效成分，包括銀杏內(nèi)酯A、B、C、M和白果內(nèi)酯。研究表明銀杏內(nèi)酯為血小板活化因子（PAF）拮抗劑，活性最強(qiáng)的即為銀杏內(nèi)酯B（GB），具有抗炎、抗氧化，抗感染等多種藥理學(xué)作用［1-3］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞模型，研究GB對(duì)H2O2損傷H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器大鼠H9C2心肌細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）；GB（美國(guó)Sigma公司，純度≥90%）；DMEM培養(yǎng)基、小牛血清（美國(guó)Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO）、甲基四唑藍(lán)（MTT，美國(guó)Sigma公司）；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、肌酸磷酸激酶（CPK）、乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測(cè)試劑盒（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性檢測(cè)試劑盒，丙二醛（MDA）含量檢測(cè)試劑盒，Caspase-3、Caspase-9活性檢測(cè)試劑盒，AnnexinV/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）；NF-κB單克隆抗體（南京建成生物工程研究所）；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （上海斯信生物科技有限公司）；AKT、bcl-2、Bax引物（上海博亞生物公司）。主要儀器包括：WT-IND型超凈工作臺(tái)（北京王堂藍(lán)翼科技有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；超速低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；FACSAria流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；BS-200全自動(dòng)生化分析儀 （深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；UV-3200PCS紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；VCX750型超聲波細(xì)胞破碎儀（美國(guó)SONICS公司）；RT-PCR儀（武漢新未來(lái)儀器技術(shù)有限公司）；DYY-11型多用電泳儀（北京六一儀器廠）；JY-SCZ2電泳槽（北京六一儀器廠）。

1.2細(xì)胞的培養(yǎng)與分組H9C2心肌細(xì)胞經(jīng)常規(guī)復(fù)蘇后接種于含15%胎牛血清、100 g/L雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液中，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中進(jìn)行培養(yǎng)，每72小時(shí)換液并傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9C2心肌細(xì)胞分為5組：對(duì)照組、H2O2（200 μmol/L）干預(yù)組、GB（50、100和200 μmol/L）+H2O2（200 μmol/L）干預(yù)組，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔。經(jīng)藥物干預(yù)16 h后，檢測(cè)各指標(biāo)。

1.3檢測(cè)指標(biāo)1）細(xì)胞存活率的檢測(cè)：采用MTT法分別測(cè)定各組細(xì)胞存活率：將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)（n=6），每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），經(jīng)37℃孵育4 h后棄上清，每孔加入150 μL DMSO后振蕩15 min，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處OD值，然后計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。2）培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH活性的測(cè)定：取細(xì)胞培養(yǎng)液并按照各試劑盒操作方法步驟，通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀平行測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH活性。3）細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT活性和MDA含量的檢測(cè)：經(jīng)離心后棄培養(yǎng)基取細(xì)胞，每孔加入2 mL PBS溶液，冰浴中破碎處理30 s后，經(jīng)3500 r/min低溫（4℃）離心10 min后取上清液，然后通過(guò)紫外-可見分光光度計(jì)平行測(cè)定各組細(xì)胞裂解液中SOD、CAT活性和MDA含量。4）細(xì)胞凋亡的檢測(cè)及細(xì)胞凋亡率的計(jì)算：采用胰酶（0.25%）消化細(xì)胞，離心后棄上清液，經(jīng)PBS溶液將洗滌2次后，按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作方法步驟加入500 μL Binding Buffer、5 μL AnnexinV、5 μL PI，混勻，室溫避光孵育10 min后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，觀察各組細(xì)胞凋亡狀況并在流式二維圖中計(jì)算凋亡率。5）細(xì)胞中AKT mRNA、bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)的檢測(cè)及bcl-2/Bax表達(dá)比值的計(jì)算：從基因庫(kù)中查閱大鼠AKT、bcl-2、Bax、βactin基因cDNA序列并通過(guò)Oligo軟件設(shè)計(jì)上、下游引物；常規(guī)消化后收集各組細(xì)胞，加入適量TRIzol試劑提取總RNA并測(cè)定總RNA濃度，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增完畢后，取PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)凝膠成像儀觀察并照相。以β-actin為內(nèi)參，由灰度值進(jìn)行半定量分析AKT mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)，并計(jì)算Bcl-2/Bax表達(dá)比值。6）NF-κB蛋白表達(dá)的檢測(cè)及半定量分析：取細(xì)胞裂解提取液，經(jīng)12000 r/min低溫（4℃）離心20 min后取沉淀，BCA法進(jìn)行蛋白定量，變性后上樣、電泳，待溴酚藍(lán)接近膠底部時(shí)停止、轉(zhuǎn)膜、春紅溶液染色，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗（NF-κB，β-actin）4℃過(guò)夜；洗膜，二抗室溫?fù)u床上孵育1 h后經(jīng)ECL顯色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用Quantity One軟件進(jìn)行分析。7）細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9活性的檢測(cè)［4］：取上述制備的細(xì)胞裂解提取液，經(jīng)3500 r/min低溫（4℃）離心10 min后，取上清液5 μL用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，各組均取等量蛋白加入5 μL Caspase-3作為底物，經(jīng)37℃避光孵育4 h后，測(cè)定405 nm處A值，以“實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值”表示Caspase-3的活性；Caspase-9活性檢測(cè)方法同Caspase-3。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　ART、Bcl-2、Bax、β-actin基因序列

2　結(jié)　果

2.1GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞存活率的影響見表2。經(jīng)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，H2O2干預(yù)組H9C2心肌細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著降低 （P<0.01）；而與H2O2干預(yù)組比較，GB（100、200 μmol/L）+H2O2（200 μmol/L）干預(yù)組細(xì)胞存活率顯著升高（P<0.01）。

表2　GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞存活率的影響（±s）

表2　GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞存活率的影響（±s）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組　別　n　劑量（μmol/L）　存活率（%）對(duì)照組　10　-　96.73±5.26 H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　-　40.20±6.31**GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　50　47.06±6.82 GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　100　62.42±7.50△△GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　200　80.67±9.56△△

表3　GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中心肌酶活性的影響（±s）

表3　GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中心肌酶活性的影響（±s）

組　別　n　劑量（μmol/L）對(duì)照組　10　-H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　-GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　50 GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　100 GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　200 AST（U/mL）21.89±4.32 36.03±6.54**31.82±7.17 27.50±5.13△23.39±5.62△△CPK（U/mL）　LDH（U/L）1.38±0.34　518.43±76.13 2.82±0.75**935.31±140.69**2.35±0.72△　864.93±132.52 2.04±0.58△△750.15±99.44△1.67±0.42△△681.94±83.67△△

2.2GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中心肌酶活性的影響見表3。H2O2干預(yù)組H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH活性顯著升高（P<0.01）；而與H2O2干預(yù)組比較，GB（100、200 μmol/L）+H2O2（200 μmol/L）干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH活性均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

2.3GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2細(xì)胞抗氧化酶活性和MDA含量的影響見表4。H2O2干預(yù)組H9C2心肌細(xì)胞抗氧化酶（SOD、CAT）活性顯著降低且MDA含量顯著升高（P<0.01）；而與H2O2干預(yù)組比較，GB（100、200 μmol/L）+H2O2（200 μmol/L）干預(yù)組細(xì)胞SOD、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。

表4　GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞抗氧化酶活性和MDA含量的影響（±s）

表4　GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞抗氧化酶活性和MDA含量的影響（±s）

組別　n　　劑量（μmol/L）對(duì)照組　10　-H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　-GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　50 GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　100 GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　200 SOD（U/mg）107.53±15.21 62.78±14.55**69.02±13.40 83.48±17.13△96.41±22.48△△CAT（U/mg）MDA（nmol/mg）32.52±6.67　6.53±1.38 18.28±5.02**　12.05±2.34**22.92±5.64　10.78±3.12 24.46±7.07△　7.57±2.04△△29.01±6.81△△　6.91±1.73△△

表5　GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞凋亡率的影響（±s）

表5　GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞凋亡率的影響（±s）

組　別　n　　劑量（μmol/L）　　凋亡率（%）對(duì)照組　10　-　3.81±1.84 H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　-　45.34±6.07**GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　50　40.23±7.46 GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　100　31.74±6.39△△GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　200　16.88±4.15△△

圖1　GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.4GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響見表5和圖1。通過(guò)流氏細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組H9C2心肌細(xì)胞僅存在極少量凋亡細(xì)胞，而H2O2干預(yù)組凋亡細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯增多；而與H2O2干預(yù)組比較，GB干預(yù)組細(xì)胞凋亡狀況明顯好轉(zhuǎn)，其中GB （200 μmol/L）+H2O2（200 μmol/L）干預(yù)組效果最為顯著。通過(guò)計(jì)算并比較凋亡率發(fā)現(xiàn)，H2O2干預(yù)組H9C2心肌細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組顯著升高（P<0.01）；而與H2O2干預(yù)組比較，GB（100、200 μmol/L）+H2O2（200 μmol/L）干預(yù)組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.01）。

2.5GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響見表6。與對(duì)照組比較，H2O2干預(yù)組H9C2心肌細(xì)胞AKT mRNA、Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著升高 （P<0.05或P<0.01），而Bcl-2/Bax表達(dá)比值顯著降低（P<0.01）；與H2O2干預(yù)組比較，GB（100、200 μmol/L）+H2O2（200 μmol/L）干預(yù)組H9C2心肌細(xì)胞AKT mRNA、Bcl-2 mRNA表達(dá)進(jìn)一步升高、Bax mRNA表達(dá)顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），Bcl-2/Bax表達(dá)比值顯著升高（P<0.01）。

表6　GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響（±s）

表6　GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響（±s）

組別　n　　劑量（μmol/L）對(duì)照組　10　-H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　-GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　50 GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　100 GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　200 AKT（×10-3）1.60±0.43 1.97±0.61*2.06±0.85 2.51±0.83△2.86±0.94△△Bcl-2（×10-3）35.13±6.75 46.34±9.02*49.76±11.21 60.49±10.67△68.07±13.15△△Bax（×10-3）　Bcl-2/Bax 64.28±17.53　0.55±0.26 119.74±26.22**0.39±0.18**103.46±31.80　0.47±0.24 91.18±29.52△△0.68±0.31△△80.35±21.72△△0.85±0.36△△

2.6GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的影響見表7和圖2。通過(guò)Western blot檢測(cè)并進(jìn)行半定量分析發(fā)現(xiàn)，H2O2干預(yù)組H9C2心肌細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著增高（P<0.01）；與H2O2干預(yù)組比較，GB（100、200 μmol/L）+H2O2（200 μmol/L）干預(yù)組H9C2心肌細(xì)胞NF-kB蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

2.7GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性的影響見表8。通過(guò)比色法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，H2O2干預(yù)組H9C2心肌細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性均顯著升高（P<0.01）；與H2O2干預(yù)組比較，GB （100、200 μmol/L）+H2O2（200 μmol/L）干預(yù)組細(xì)胞Caspase-3活性顯著降低（P<0.05，P<0.01），其中GB （200 μmol/L）+H2O2（200 μmol/L）干預(yù)組Caspase-9活性顯著降低（P<0.01）。

圖2　GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的影響

表7　GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的影響（±s）

表7　GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的影響（±s）

組　別　n　　劑量（μmol/L）　NF-κB/β-actin對(duì)照組　10　-　0.18±0.03 H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　-　0.47±0.11**GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　50　0.39±0.14 GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　100　0.34±0.08△GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　200　0.27±0.06△△

表8　GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性的影響（×10-3，±s）

表8　GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性的影響（×10-3，±s）

組　別　n　劑量（μmol/L）對(duì)照組　10　-H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　-GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　50 GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　100 GB+H2O2（200 μg/mL）干預(yù)組　10　200 Caspase-3 54.75±7.63 103.41±11.5**95.68±13.55 86.01±10.42△72.93±8.35△△Caspase-9 71.49±9.35 124.82±19.27**115.26±26.03 109.55±20.49 84.67±16.82△△

3　討　論

近年來(lái)，劉艷霞等［5］和孫宇等［6］通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研發(fā)發(fā)現(xiàn)，繼發(fā)性心肌細(xì)胞凋亡與心肌缺血再灌注損傷密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡是一種有多種基因參與調(diào)控的程序化死亡過(guò)程，Bcl-2家族基因發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。Bcl-2和Bax都屬于Bcl-2家族基因，Bcl-2為抑凋亡基因、Bax為促凋亡基因，二者間相互作用、共同調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程［7］；并且細(xì)胞凋亡的調(diào)控不僅與Bcl-2、Bax表達(dá)密度有關(guān)，甚至更依賴于Bcl-2/Bax表達(dá)比值，Bcl-2/Bax比值越低，往往凋亡狀況越嚴(yán)重［8］。AKT為抗凋亡基因，參與細(xì)胞凋亡過(guò)程的調(diào)控，在細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)及整個(gè)過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［9］。Caspases蛋白家族參與細(xì)胞凋亡啟動(dòng)以及整個(gè)過(guò)程的調(diào)節(jié)，其中Caspase-3被認(rèn)為是各種凋亡刺激因子激活的關(guān)鍵蛋白酶［9］，而Caspase-9為Caspase-3的活化刺激因子［10］。

細(xì)胞凋亡可由多種因素導(dǎo)致其發(fā)生，其中氧化應(yīng)激損傷是其重要的誘發(fā)因素之一［11］。NF-κB為多效能核轉(zhuǎn)錄因子，常態(tài)下，NF-κB以無(wú)活性形式存在于胞質(zhì)中；而當(dāng)細(xì)胞受到外界因素刺激時(shí)，NF-κB將暴露出核定位信號(hào)并進(jìn)入胞核內(nèi)，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。Zhang Q等［12］研究發(fā)現(xiàn)，制NF-κB激活能夠?qū)寡趸瘧?yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，證實(shí)NF-κB激活與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。細(xì)胞中ROS含量是反映機(jī)體氧自由基損傷最直接的指標(biāo)，ROS損傷被認(rèn)為是引起心肌細(xì)胞氧化損傷的主要機(jī)制［13］；Lartigue A等［14］研究發(fā)現(xiàn)，正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)生成的氧自由基在qSOD的催化作用下能夠被還原生成過(guò)氧化氫，并在CAT或GSH-Px的催化作用下進(jìn)一步還原生成對(duì)人無(wú)害的水和氧［15］，所以SOD、CAT和GSH-Px三者的活性直接反映機(jī)體抗氧化能力；此外，細(xì)胞膜極易受氧自由基的攻擊發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化而生成MDA，所以血清中MDA的含量能夠間接反映心肌細(xì)胞損傷程度。并且當(dāng)細(xì)胞膜受氧自由基攻擊而受損后，將導(dǎo)致細(xì)胞中心肌酶（AST、CPK、LDH）迅速釋放入血，使血清中AST、CPK、LDH活性陡然增高，所以臨床上將血清中心肌酶活性作為診斷早期心功能損傷的常用生化指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，GB能夠有效改善H2O2誘導(dǎo)損傷H9C2心肌細(xì)胞凋亡狀況、降低細(xì)胞凋亡率、提高細(xì)胞存活率，提示GB對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用；其作用機(jī)制可能與GB能夠有效上調(diào)抑凋亡基因AKT mRNA、Bcl-2 mRNA表達(dá)、下調(diào)促凋亡基因Bax mRNA表達(dá)、提高Bcl-2/Bax表達(dá)比值、降低Caspase-3和Caspase-9活性，以及改善抗氧化酶活性、降低氧化應(yīng)激損傷，下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)有關(guān)。

［1］Nie ZG，Peng SY，Wang WJ.Effects of Ginkgolide B on lipopolysaccharide-induced TNFalpha production in mouse peritoneal macrophages and NF-κB activation in rat pleural polymorphonuclear leukocytes［J］.Acta Pharm Sin，2004，39：415-418.

［2］Zhou LE，Wang WJ，Bai JY，et al.Effects of Ginkgolide B on arachidonic acid metabolizing enzymes and level of intracellular calcium in rat polymorphonuclear leukocytes［J］.Acta Pharm Sin，2001，36（2）：92-95.

［3］Kitamoto S，Egashira K.Endothelial dysfunction and coronary atherosclerosis［J］.Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord，2004，4（1）：13-22.

［4］陳良金，石孟瓊，賀海波，等.珠子參總皂苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2012，17（8）：860-867.

［5］劉艷霞，顧云，辛毅，等.大鼠急性心肌缺血再灌注損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究［J］.心肺血管病雜志，2009，28（3）：191-194.

［6］孫宇，陳建光.細(xì)胞凋亡與心肌缺血再灌注損傷研究［J］.北華大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，10（1）：34-43.

［7］張彥清，劉保江，田首元.丙泊酚對(duì)大鼠離體缺血/再灌注心肌細(xì)胞凋亡和bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2011，9（1）：55-57.

［8］Jayanthi S，Deng X，Bordelon M，et al.Methamphetamine causes differential regulation of pro-death and anti-death bcl-2 genes in the mouse neocortex［J］.FASEB J，2001，15 （10）：1745-1752.

［9］毛德文，陳月橋，王麗，等.Caspase-8及Caspase-3與細(xì)胞凋亡［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，10（10）：148-150.

［10］王春光，劉北忠，金丹婷，等.大黃素對(duì)裸鼠體內(nèi) K562細(xì)胞移植瘤的抑制作用及其與調(diào)控Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的關(guān)系［J］.中草藥，2010，41（5）：751-756.

［11］陳良金，石孟瓊，賀海波，等.珠子參總皂苷對(duì) H2O2誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2012，17（8）：860-867.

［12］Zhang Q，Huang WD，Lv XY，et al.Ghrelin protects H9c2 cells from hydrogen peroxide-induced apoptosis through NF-κB and mitochondria-mediated signaling［J］.Eur J Pharmacol，2011，654（2）：142-149.

［13］Misra MK，Sarwat M，Bhakuni P，et al.Oxidative stress and ischemic myocardial syndromes［J］.Med Sci Monit，2009，15 （10）：209-219.

［14］Lartigue A，Burlat B，Coutard B，et al.The megavirus chilensis Cu，Zn-superoxide dismutase：the first viral structure of a typical CCS-independent hyperstable dimeric enzyme［J］.J Virol，2014，2588（14）：254-261.

［15］Jin Y，Liu K，Peng J，et al.Rhizoma dioscoreae nipponicae polysaccharides protect HUVECs from H2O2-induced injury by regulating PPARγ factor and the NADPH oxidase/ROSNF-κB signal pathway［J］.Toxicol Lett，2014，232（1）：149-158.

The Effects and Mechanism of Ginkgolide B on Apoptosis of H9C2 Cardiomyocytes Induced by H2O2

LI Liang，PENG Hui，SUN Lifeng，et al. Xingtai People′s Hospital，Hebei，Xingtai 054031，China.

R289.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

1004-745X（2016）06-0976-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.010

河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科技研究計(jì)劃（20130359）

△（電子郵箱：baill2015@163.com）

（2015-11-09）