韓　進　范紅晶　楊潔紅　李　敏　張宇燕（浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053）

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腦缺血再灌注大鼠灌胃養(yǎng)陰通腦顆粒后主要成分葛根素的藥動學研究*

韓進范紅晶楊潔紅李敏張宇燕△
（浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053）

目的 采用腦-頸靜脈雙通道微透析法觀察大鼠灌胃養(yǎng)陰通腦顆粒后主要成分葛根素的藥動學參數。方法 采用HPLC技術建立大鼠腦和頸靜脈微透析液中葛根素的含量測定方法，并考察微透析探針回收率；大鼠植入頸靜脈和腦微透析探針引導管，并制作大鼠大腦中動脈局灶性栓塞（MCAO）模型。灌胃給予2.5 g/mL養(yǎng)陰通腦顆粒，測定腦、頸靜脈微透析液葛根素的濃度變化，參數擬合分析藥動學參數。結果 觀察MCAO模型大鼠灌胃給予2.0 g/mL養(yǎng)陰通腦顆粒后微透析液中葛根素的濃度，發(fā)現(xiàn)腦內葛根素濃度低于頸靜脈，Tmax更加靠后，葛根素生物利用度在腦部明顯低于血液中。結論 建立的腦-頸靜脈雙通道微透析技術分析獲得大鼠不同部位的藥-時曲線，有助于開展中藥及相關制劑的藥動學數據及成分分布、生物利用度等參數。

腦-頸靜脈雙通道微透析腦缺血再灌注養(yǎng)陰通腦顆粒葛根素藥動學

【Abstract】Objective：To study the pharmacokinetics of Puerarin in cerebral ischemia-reperfusion rats after intragastric administration of Yangyin Tongnao decoction by brain-jugular dual-channel microdialysis.Methods：HPLC was adopted to establish the determination method of Puerarin in microdialysates of cerebral and jugular veins，and the recovery rate of probe was detected.The guide tube was used to insert the jugular vein and brain microdialysis probe，making rats model of focal middle cerebral artery occlusion（MCAO）.After intragastric administration of 2.5 g/mL Yangyin Tongnao decoction，the concentration of puerarin in brain and neck vein microdialysates were detected by using parameter fitting to analyze the pharmacokinetic parameters.Results：By observing the concentration of puerarin in brain and neck vein microdialysates after intragastric administration of 2.5 g/mL Yangyin Tongnao decoction in MCAO models，the the concentration of puerarin in brain was lower than that in neck vein，as well as Tmax.Bioavailability of Puerarin in brain was obviously lower than that in the blood. Conclusion：obtaining different parts of the concentration-time curve by using the brain-jugular dual-channel microdialysis，it will be beneficial to the pharmacokinetic analysis of traditional Chinese medicine（TCM）and pharmaceutics and the study of composition distribution，bioavailability，and so on.

【Key words】Brain-jugular vein dual-channel microdialysis；Cerebral ischemia-reperfusion；Yangyin Tongnao decoction；Puerarin；Pharmacokinetics

微透析采樣技術（Microdialysis）是將一種具有半透膜的探針置于實驗動物的特定組織中，利用泵推送溶液至探針處，使組織內的目標物質通過半透膜擴散到探針內，以達到從組織內取出需要測量的低分子量物質的目的，以便進一步的分析。這種取樣技術將灌流取樣和透析技術相結合，具有活體、原位連續(xù)取樣、動態(tài)觀察、定量分析、采樣量小、組織損傷輕、在線檢測等特點。目前該技術被廣泛應用于各種生理病理現(xiàn)象的探索性實驗和神經生物化學的監(jiān)測等［1］。由于血腦屏障阻擋了病原生物及其他大分子物質由血液循環(huán)系統(tǒng)進入腦室和腦組織中［2］，從而影響藥物進出腦部的轉運過程，導致腦內和血液中的藥物濃度不完全一致。而血-腦雙通道微透析技術結合HPLC技術，可同時檢測腦部細胞外液中游離藥物濃度與血液中藥物濃度，更客觀地反映藥物通過血腦屏障的程度及藥物在腦內的分布和清除狀況［3］。研究動物給藥后透過血腦屏障有效成分的比例對進一步明確其臨床療效有積極意義。

養(yǎng)陰通腦顆粒是由野葛根、生地黃、生黃芪和川芎等制成的無糖顆粒，具有益氣活血、擴張血管、抗栓等功效［4］。養(yǎng)陰通腦顆粒目前已獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局臨床研究批件，在臨床主要用于治療腦血管疾病。其中主要組成藥物葛根中的葛根素可改善心腦血管循環(huán)，增強心肌收縮力，保護心肌細胞、降低心肌耗氧量，降低血壓，具有抗血小板聚集，降低血糖等多種藥理作用［5-7］。本實驗采用雙通道微透析取樣技術，在不同時間點通過大鼠頸靜脈和腦部植入的微透析探針引導管，同步取腦和頸靜脈微透析液，結合高效液相色譜法，給予腦缺血再灌注模型大鼠灌胃養(yǎng)陰通腦顆粒后檢測葛根素的血藥濃度和腦藥濃度，從而探討灌胃養(yǎng)陰通腦顆粒后葛根素的腦內、頸靜脈內的藥動學變化情況?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與試劑

1.1儀器

高效液相色譜儀：日本島津LC-10AD，紫外檢測器。微透析設備：灌注器推進泵（Baby Bee Syringe Drive MD 1001），灌注器 （1 mL Bee Stinger Gastight Syringe，MD 0100），灌注器支架（3-Syringe Bracket for Baby Bee，MD 1002），流速控制器 （Work Bee Controller，MD 1000）（均為美國BAS公司），頸靜脈微透析探針（膜長10 mm，截留相對分子質量為18000D，美國Spectrum公司），腦微透析探針（膜長4 mm，截留分子量為18000 D，美國Spectrum公司），以上均為浙江大學生物工程與儀器分析學院提供；AG135電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司生產。

1.2藥物與試劑

養(yǎng)陰通腦顆粒：浙江中醫(yī)藥大學心腦血管病研究所提供，批號2009L00307。葛根素標準品：中國藥品生物制品檢定所，批號：110752-201009，HPLC檢測純度＞98%。甲醇（色譜純，天津四友生物醫(yī)學技術有限公司生產）；其余均為分析純。

1.3實驗動物

老年清潔級SD大鼠，體質量（275±25）g，2月齡，雄性，購于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，實驗室符合國家動物實驗設施屏障系統(tǒng)標準，動物許可證號SCXK（滬）2013-0016。實驗前12 h禁食，自由飲水。

2　方法與結果

2.1養(yǎng)陰通腦顆粒溶液的制備

稱取養(yǎng)陰通腦顆粒用0.9%氯化內注射液配制成2.0 g/mL的溶液。

2.2頸靜脈及腦微透析探針引導管植入［6］

2.2.1大鼠頸靜脈微透析探針引導管植入稱體質量后用水合氯醛（400 mg/kg）腹腔麻醉，在背頸部開口，左頸靜脈處開兩口；用透皮針將引導管從背頸部沿皮下穿到頸靜脈上口，并用細棉線將其固定在頸部上口處；用透皮針將引導管從上口穿到下口，將兩股細棉線穿過下口上部備用；暴露頸靜脈，將血管兩端打活結；將引導管穿入靜脈約8 mm；用粗棉線將血管連同引導管系牢，用細棉線使引導管固定在皮膚上；觀察回血，注入少量肝素后縫合皮膚；背部用棉線將引導管固定在皮膚出口處。

2.2.2大鼠腦微透析探針引導管植入將透析套管定位于右側紋狀體并使用牙科水泥固定在顱骨上，術后肌注青霉素消炎。在25～30℃條件下恢復5～7 d，外形無萎靡不振等不良手術反應。

2.2.3術后護理肌注青霉素，用熱光燈照射12h使其恢復體溫，隔天在引導管中注入0.1 mL肝素；22℃左右溫度下大鼠恢復3 d，直至恢復正常的行動與飲食，外形無不良手術反應等。

2.3大鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立

大鼠水合氯醛（400 mg/kg）麻醉后，暴露右側頸總動脈（CCA），頸內動脈（ICA）和頸外動脈（ECA）。用絲線將遠心端的頸外動脈結扎，并在頸外動脈近分叉處栓線備用，用微型動脈夾夾閉頸總動脈和頸內動脈。在頸外動脈近分叉處剪一小口，將一段頭端光滑圓球的魚線，自開口插入，輕柔推進栓線，輕開頸內動脈上的動脈夾，使栓線沿頸內動脈進入到大腦中動脈（MCA）的起始端，用備用絲線固定栓線，從頸外動脈分叉處到遇到阻力點（腦中動脈起始處）約18～20 mm即可，并記錄開始缺血時間［9］。整個過程用照明燈保持直腸溫度在36～37℃。缺血1 h后退栓線，打開頸總動脈上的動脈夾行再灌注。在再灌注同時灌胃給予2 g/kg養(yǎng)陰通腦顆粒 （根據葛根素含量計算葛根素濃度為6.75 mg/mL）。

2.4血、腦內透析液的收集

開啟微透析灌流系統(tǒng)，灌注液為0.9%氯化鈉注射液，灌速2 μL/min，平衡10 min后開始收集透析液，每10分鐘收集1次，HPLC檢測無干擾峰后，行MCAO術，再灌注60 min后每15分鐘收集一次透析液，直至采集體積為50 μL，透析液高效液相分析。

2.5腦-頸靜脈透析液中葛根素含量測定方法的建立

2.5.1葛根素對照品溶液的配制精密稱取1.0 mg葛根素對照品，用70%甲醇-水溶解，并定容至10 mL，配成濃度為0.1 mg/mL準溶液，再取0.1mL葛根素標準溶液，定容至100 mL，得到濃度為0.1 μg/mL的葛根素標準溶液。同法配制0.025 mg/mL的對羥基苯甲酸標準溶液作為內標。

2.5.2色譜條件固定相：phenomenex GEMINI C18柱，150 mm×4.6 mm，5 μm。流動相：甲醇-0.5%醋酸（27∶73，v∶v）。柱溫：25℃。流速：1.0 mL/min，紫外檢測波長：250 nm。進樣量：10 μL，理論塔板數以葛根素計均大于5000。

2.5.3標準曲線及最低檢測限取空白透析液0.3 mL，分別加入葛根素標準溶液制成梯度質量濃度為：0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μg/mL，在每管中分別加入內標液15 μL。以葛根素和內標物的峰面積比值與葛根素的濃度作線性回歸，達到葛根素的線性回歸方程為：Y=2.5766x-0.049，R=0.9994，在0.025～0.8 μg/mL范圍內，葛根素呈良好的線性關系。測得信噪比為3時的最低檢測限為0.015 ng，最低檢測質量濃度為5 ng/mL。色譜分離見圖1。

圖1　葛根素高效液相色譜圖

2.5.4精密度實驗以空白透析液作底物，分別加入葛根素對照品使質量濃度分別為0.025、0.2、0.8 μg/mL （n=6），測定同1 d內不同時間和在不同天數葛根素含量，結果日內精密度分別為4.02%、2.78%、2.83%，日間精密度分別為5.37%、3.65%、6.17%。

2.5.5回收實驗空白透析液中分別加入高、中、低3個濃度的葛根素標準溶液，質量濃度分別為0.025、0.4、3.2 μg/mL（每個質量濃度平行做5份），在每管中分別加入內標液15 μL，按照標準曲線項下方法處理樣品，測定回收率。結果平均回收率為（92.45±1.38）%，（85.37±3.28）%，（88.38±2.28）%，RSD為7.65%，4.37%，5.23%。

2.6微透析探針回收率測定［10］

利用體外血漿溶液考察探針相對回收率：在體實驗前分別將腦微透析探針和靜脈微透析探針放入10 μg/mL葛根素血漿溶液浸泡。0.9%氯化鈉注射液作為灌注液，將0.9%氯化鈉注射液以2μL/min流速進行灌注，平衡30 min后，每次收集透析液30 μL，收集3次，灌注6 h。體外回收率（Recgain）的計算公式為：

其中，cdial為透析液中平均藥物濃度；cm為探針的環(huán)境藥物濃度。由公式計算探針相對回收率分別為（10.12±0.17）%，（10.24±0.13）%。

2.7腦-頸靜脈透析液中葛根素濃度的測定及藥動學參數計算［11］

分別測定不同時間點腦、頸靜脈透析液中葛根素的濃度，透析液收集過程中的平均值即為微透析分析的血藥濃度，將該濃度的時間近似記為采集的時間中點值，見圖2。采用中國藥理學會3P97藥動學軟件，將葛根素動態(tài)血藥濃度變化數據進行計算并擬合判別，得到葛根素的藥動學各項參數，結果見表1。從圖1和表1中可以看出腦部藥物的分布明顯低于頸靜脈部位的藥物分布，腦部Cmax低于頸靜脈處；腦部Tmax更加靠后，腦部生物利用度明顯低于血液中。

圖2　頸靜脈微透析和腦部微透析液中葛根素濃度經時變化曲線對比（μg/mL，n=8）

表1　大鼠腦和頸靜脈多通道微透析葛根素藥代動力學參數（±s）

表1　大鼠腦和頸靜脈多通道微透析葛根素藥代動力學參數（±s）

藥動學參數　　頸靜脈微透析Cmax（μg/mL）　0.46±0.01 Tmax（min）　73.35±0.56 HVD（min）　40.14±0.43腦微透析0.36±0.02 89.61±0.63 39.08±0.53 AUC0-∞［min/（μg·mL）］　27.49±2.27　17.67±3.02 AUMC0-∞　2543.90±120.30　1542.41±117.90 MRT0-∞（min）　92.54±9.21　87.31±9.00

3　討　論

葛根素在治療心腦血管疾病方面有很好的療效，已有較多的相關文獻報道證實，但對于葛根素在同一時間、不同部位的藥動學比較目前尚未見研究報道，因此，本實驗的研究對于提高養(yǎng)陰通腦顆粒的有效成分在體內的分布、以及生物利用度等研究有極大的指導意義。

本實驗結果顯示，腦部葛根素的分布明顯低于頸靜脈部位，腦部葛根素的高峰值低于頸靜脈處葛根素的峰值；腦部Tmax更加靠后，腦部葛根素高峰的出現(xiàn)較頸靜脈晚，說明腦部生物利用度明顯低于血液生物利用度。若采用常規(guī)的藥動學研究血藥濃度的分析方法，不僅對動物刺激大，還會對藥物的藥動學過程產生較大的影響，又因小動物血容量小，多次取血可能會影響藥物的分布與代謝，故不適合此次實驗。微透析技術由于其優(yōu)勢突出，可在頸靜脈內進行連續(xù)微透析采樣［13］，可在不同組織、不同器官或同一器官不同部位同時分別取樣，實現(xiàn)清醒動物多部位的藥物濃度測定，有助于闡述藥物的體內過程、分布、作用機制及靶向性，在醫(yī)學、藥學、生命科學等研究領域中越來越得到廣泛應用［12］。

本實驗通過建立腦-頸靜脈雙通道微透析技術結合HPLC技術測定從而獲得不同部位的藥-時曲線，同時檢測腦內細胞外液的游離藥物濃度與血液中藥物濃度，客觀地反映葛根素在腦組織、血液中的分布、吸收、代謝等情況。其次藥物在腦部的轉運吸收與血腦屏障（BBB）密切相關［14-15］，血腦屏障能夠阻止某些物質進入腦組織，因此，葛根素在腦內的分布、吸收可能與BBB相關，而微透析技術能夠準確地檢測腦組織中游離型藥物的含量、分布。葛根素在腦組織中的濃度明顯低于頸靜脈中濃度，表明葛根素是與血漿蛋白進行了結合［16-17］，因此不能發(fā)揮相應的藥物作用，使游離型藥物含量降低，降低了血腦屏障通過率，降低了在腦內的含量，因此在以后的研究中，需要深入研究葛根素與血腦屏障之間的作用機制，以提高葛根素在腦內組織的分布等情況，使養(yǎng)陰通腦顆粒在治療心腦血管疾病方面取得更好的臨床療效，可更好地為指導臨床用藥提供合理的理論依據。

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Pharmacokinetics Research of Puerarin on Cerebral Ischemia-reperfusion Rats after Intragastric Admin-istration of Yangyin Tongnao Decoction by Brain-jugular Vein Dual-channel Microdialysis

HAN Jin，F(xiàn)AN Hongjing，YANG Jiehong，et al.Zmixtureang University of Chinese Medicine，Zmixtureang，Hangzhou 310053，China.

R285.5文獻標志碼：A

1004-745X（2016）06-0945-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.002

國家自然科學基金（81403284，81374053）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2013ZA029）

△（電子郵箱：yannoo7376@sina.com）

（2015-08-20）