劉晨晨樊　葉關(guān)　月姜宗丹汪志兵王勁松黃文斌張振玉#

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院)消化科1(210006)　病理科2濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院消化科3

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替格瑞洛對(duì)大鼠胃潰瘍愈合的影響及其機(jī)制研究

劉晨晨1，3*樊葉1關(guān)月1姜宗丹1汪志兵1王勁松2黃文斌2張振玉1#

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院)消化科1(210006)病理科2濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院消化科3

背景：新型抗血小板藥物替格瑞洛對(duì)消化道有潛在損傷風(fēng)險(xiǎn)。目的：探討替格瑞洛對(duì)大鼠胃潰瘍愈合的影響及其可能機(jī)制。方法：96只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和替格瑞洛低劑量、高劑量組，制作乙酸胃潰瘍模型，造模后第3 d開始分別予0.5% CMC-Na、21 mg/kg和42 mg/kg替格瑞洛灌胃干預(yù)。于第3、5、7、9 d 分批處死大鼠，評(píng)估胃潰瘍愈合和黏膜損傷情況，以免疫組化法和蛋白質(zhì)印跡法檢測潰瘍邊緣胃黏膜血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)，TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：第9 d時(shí)，替格瑞洛干預(yù)組胃潰瘍面積和黏膜損傷指數(shù)均顯著大于對(duì)照組(P<0.05)，且高劑量組顯著大于低劑量組(P<0.05)，同時(shí)潰瘍邊緣胃黏膜中VEGF、EGF、PCNA表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡增加，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但替格瑞洛高、低劑量組在VEGF表達(dá)、細(xì)胞凋亡方面無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論：替格瑞洛可延遲大鼠胃潰瘍愈合，其機(jī)制可能是通過下調(diào)胃黏膜中的VEGF、EGF表達(dá)、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡而減緩潰瘍修復(fù)過程。

替格瑞洛；胃潰瘍；血管內(nèi)皮生長因子類；表皮生長因子；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

Correspondence to:ZHANG Zhenyu,Email:njzzy808@163.com

Background:Ticagrelor is a novel anti-platelet agent that may cause gastrointestinal adverse events.Aims:To investigate the effect of ticagrelor on gastric ulcer healing in rats and its possible mechanism.Methods:Ninety-six male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups:control group,low-dose ticagrelor group and high-dose ticagrelor group.Gastric ulcer was induced by using acetic acid and 0.5% CMC-Na,21 mg/kg ticagrelor and 42 mg/kg ticagrelor were given intragastrically from the 3rd day of model construction,respectively.Animals were sacrificed in batches on the 3rd,5th,7th and 9th day.The ulcer healing and mucosal injury were assessed macro- and microscopically.Immunohistochemistry and Western blotting were used to determine the expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF),epidermal growth factor (EGF) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in mucosal tissue at ulcer margin,and gastric cell apoptosis was detected by TUNEL assay.Results:On the 9th day,the area of gastric ulcer and mucosal injury index in ticagrelor groups were significantly higher than those in control group (P<0.05),and those in high-dose ticagrelor group were significantly higher than those in low-dose group (P<0.05).Meanwhile,the expressions of VEGF,EGF and PCNA in mucosal tissue at ulcer margin were decreased in ticagrelor groups,and apoptotic cells was increased (P all <0.05).No significant differences in VEGF expression and cell apoptosis were found between low-dose and high-dose ticagrelor groups (P>0.05).Conclusions:Ticagrelor delays gastric ulcer healing in rats possibly through reducing VEGF and EGF expression,inhibiting cell proliferation as well as promoting cell apoptosis,thus collectively hindering the ulcer healing process.

抗血小板藥物在心腦血管疾病的一、二級(jí)預(yù)防中起重要作用。替格瑞洛(ticagrelor)是一種口服抗血小板藥物，能可逆性地結(jié)合并抑制腺苷二磷酸(ADP)受體P2Y12，從而起到抗血小板作用，是治療急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)的新型藥物[1-2]，因能快速、有效地抑制血小板而被多個(gè)國內(nèi)外指南推薦使用。PLATO研究[1]顯示，與氯吡格雷相比，替格瑞洛可顯著減少ACS患者的心血管不良事件而不增加主要出血事件，但在次要出血和輕微出血方面，替格瑞洛則有增多的趨勢，盡管差異未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但替格瑞洛對(duì)消化道的潛在損傷風(fēng)險(xiǎn)仍不容忽視。本研究應(yīng)用實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍大鼠模型，探討替格瑞洛對(duì)胃潰瘍愈合的影響及其可能機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

雄性Sprague-Dawley大鼠96只，3月齡，體質(zhì)量180～220 g，由南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(蘇)2009-0015。飼養(yǎng)條件：溫度(24±2) ℃，濕度55%±5%，噪音<50 dB，每12 h一次明暗循環(huán)，平衡飼料分籠飼養(yǎng)，每籠8只，自由飲水。替格瑞洛為阿斯利康公司產(chǎn)品，批號(hào)2403821240，以0.5% CMC-Na配制成懸濁液。兔血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多克隆抗體、山羊表皮生長因子(EGF)多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)，鼠增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，EnVision免疫組化檢測試劑盒(DAKO)，TUNEL凋亡檢測試劑盒(Roche Diagnostics)。

二、方法

1.動(dòng)物分組和藥物干預(yù)：96只大鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組和替格瑞洛低劑量、高劑量組，每組32只。大鼠適應(yīng)性觀察7 d后開始造模，造模后第3 d(即潰瘍形成第1 d)開始予藥物干預(yù)，對(duì)照組予 0.5% CMC-Na灌胃，替格瑞洛低劑量和高劑量組分別 予替格瑞洛21 mg/kg(按人類長期口服劑量 75 mg/d 折算)和 42 mg/kg 灌胃，禁食18 h后每天上午給藥一次，直至處死。造模后第3、5、7、9 d每組隨機(jī)選取8只大鼠，禁食不禁水24 h后10%水合氯醛腹腔麻醉、處死，取胃組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.乙酸胃潰瘍模型制作：造模前禁食不禁水24 h，參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[3-4]，以10%水合氯醛麻醉大鼠，腹部手術(shù)將胃拉出腹腔，以內(nèi)徑6 mm的塑料管緊貼胃體與幽門交接處漿膜面，注入100%乙酸75 μL，作用26 s后移除，依次縫合腹壁各層。

3.標(biāo)本處理和病理學(xué)檢查：分離胃周圍血管和組織，結(jié)扎食管末端和十二指腸上端后將胃取出，沿大彎側(cè)切開，冷0.9% NaCl溶液洗凈胃黏膜，觀察潰瘍愈合情況，留取大體照片。潰瘍周圍組織部分以4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織學(xué)改變；另一部分-80 ℃保存待測。

4.評(píng)估指標(biāo)

①潰瘍面積：胃黏膜洗凈后以濾紙吸干、展平，先將潰瘍輪廓描記于透明膠片上，再拷貝至mm2方格紙上，計(jì)算潰瘍面積。

②胃黏膜損傷指數(shù)(lesion index,LI)：采用Guth標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算胃黏膜LI[5]。斑點(diǎn)樣損傷，1分；損傷長度<1 mm，2分；1～2 mm，3分；2～4 mm，4分；≥4 mm，5分；損傷寬度>2 mm時(shí)積分值翻倍。

③胃黏膜VEGF表達(dá)：采用免疫組化EnVision二步法進(jìn)行檢測。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。結(jié)果判斷參照Brown等[6]采用的方法并略作修改，每張切片選取5個(gè)200倍視野，每視野隨機(jī)觀察100個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞并判斷染色強(qiáng)度。每視野陽性細(xì)胞數(shù)：<5，0分；5～25，1分；26～50，2分；>50，3分。染色強(qiáng)度：無著色，0分；淡黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。免疫組化評(píng)分為兩項(xiàng)評(píng)分之和：0分，陰性(-)；1～3分，弱陽性(+)；4～5分，中度陽性(++)；6分，強(qiáng)陽性(+++)。細(xì)胞計(jì)數(shù)由2名病理醫(yī)師獨(dú)立完成，差值在10%以上則重新計(jì)數(shù)。

④胃黏膜EGF、PCNA表達(dá)：采用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行檢測。取約100 mg潰瘍周圍胃黏膜組織，蛋白裂解液裂解、提取總蛋白；總蛋白與上樣緩沖液混合，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后加入EGF、PCNA抗體，4 ℃過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗，ECL法顯影、照相，ImageJ 軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

⑤胃黏膜細(xì)胞凋亡：采用TUNEL法進(jìn)行檢測。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。每張切片選取5個(gè)200倍視野，每視野隨機(jī)觀察100個(gè)細(xì)胞，染色陽性物質(zhì)呈棕黃色，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率，即凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)　　果

一、乙酸胃潰瘍模型潰瘍愈合情況

造模后第3 d，對(duì)照組、替格瑞洛低劑量和高劑量組分別有1只、2只和1只大鼠死亡，解剖見胃潰瘍深大、穿孔，腹腔黏連嚴(yán)重，之后未再有大鼠死亡，各組潰瘍面積均隨時(shí)間延長而逐漸縮小(P<0.05)。第3 d、第5 d時(shí)各組間潰瘍面積無明顯差異(P>0.05)；第7 d時(shí)替格瑞洛干預(yù)組顯著大于對(duì)照組(P<0.05)，但高、低劑量組間無明顯差異(P>0.05)；第9 d時(shí)替格瑞洛干預(yù)組顯著大于對(duì)照組(P<0.05)，且高劑量組顯著大于低劑量組(P<0.05)，該時(shí)點(diǎn)三組胃黏膜LI變化趨勢與潰瘍面積相一致(兩兩比較P均<0.05)(表1、圖1)。因此采用第3 d、第9 d標(biāo)本行各項(xiàng)指標(biāo)分析。

A：第3 d；B、C、D：第9 d；B：對(duì)照組；C：替格瑞洛低劑量組；D：替格瑞洛高劑量組

圖1各組大鼠胃大體形態(tài)變化

二、胃黏膜組織學(xué)變化

第3 d時(shí)，大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)失去連續(xù)性和完整性，可見上皮細(xì)胞脫落、破碎，出現(xiàn)大片壞死灶，潰瘍可深達(dá)黏膜肌層，腺體結(jié)構(gòu)破壞，大量炎性細(xì)胞浸潤。第9 d時(shí)，對(duì)照組潰瘍瘢痕性愈合，黏膜表面見輕微壞死灶，基本局限于黏膜層，腺體排列稍紊亂，周邊黏膜炎性細(xì)胞浸潤減輕；替格瑞洛低劑量組見淺層小片狀壞死灶，少數(shù)深達(dá)肌層，腺體排列紊亂，周邊仍有大量炎性細(xì)胞浸潤；替格瑞洛高劑量組仍有片狀壞死灶，部分深達(dá)肌層，多數(shù)仍有腺體結(jié)構(gòu)紊亂、炎性細(xì)胞浸潤等表現(xiàn)(圖2)。

A：第3 d；B、C、D：第9 d；B：對(duì)照組；C：替格瑞洛低劑量組；D：替格瑞洛高劑量組

圖2各組大鼠胃黏膜組織學(xué)變化(HE染色，×100)

三、胃黏膜VEGF表達(dá)

免疫組化檢測顯示，VEGF免疫陽性物質(zhì)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈粗細(xì)不等、深淺不一的棕色顆粒。第3 d時(shí)潰瘍邊緣胃黏膜中僅有少量VEGF表達(dá)，強(qiáng)陽性率為0%，表達(dá)評(píng)分為2.375±1.188。第9 d時(shí)，對(duì)照組強(qiáng)陽性率87.5%(7/8)，表達(dá)評(píng)分5.875±0.354；替格瑞洛低劑量組強(qiáng)陽性率37.5%(3/8)，表達(dá)評(píng)分4.250±1.581；替格瑞洛高劑量組強(qiáng)陽性率 25.0%(2/8)，表達(dá)評(píng)分4.000±1.414；替格瑞洛干預(yù)組強(qiáng)陽性率和表達(dá)評(píng)分均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，但高、低劑量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

A：第3 d；B、C、D：第9 d；B：對(duì)照組；C：替格瑞洛低劑量組；D：替格瑞洛高劑量組

圖3各組大鼠胃黏膜VEGF表達(dá)(EnVision二步法，×200)

四、胃黏膜EGF、PCNA表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，第9d時(shí)替格瑞洛干預(yù)組潰瘍邊緣胃黏膜中EGF、PCNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，且高劑量組顯著低于低劑量組(P<0.05)(圖4)。

表1　各組大鼠胃潰瘍面積和胃黏膜LI比較±s)

五、胃黏膜細(xì)胞凋亡

TUNEL法檢測顯示，棕黃色陽性物質(zhì)主要定位于凋亡細(xì)胞核內(nèi)，濃縮的核質(zhì)緊貼于核膜，呈均勻染色。第3 d時(shí)潰瘍邊緣胃黏膜中凋亡細(xì)胞較多，黏膜全層均有顯色，呈彌漫性分布，AI 44.00±5.15。第9 d時(shí)，對(duì)照組凋亡細(xì)胞較少，主要位于表面上皮，呈散在分布，AI 27.50±4.11；替格瑞洛低劑量組凋亡細(xì)胞仍較多，黏膜全層均可見，多數(shù)為彌漫性分布，少數(shù)散在分布，AI 40.87±3.14；替格瑞洛高劑量組凋亡細(xì)胞更多，全層彌漫性分布，偶見散在分布，AI 41.62±3.81；替格瑞洛干預(yù)組AI顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但高、低劑量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖5)。

1：對(duì)照組；2：替格瑞洛低劑量組；3：替格瑞洛高劑量組

A：第3 d；B、C、D：第9 d；B：對(duì)照組；C：替格瑞洛低劑量組；D：替格瑞洛高劑量組

圖5各組大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡情況(TUNEL法，×200)

討　　論

抗血小板藥物是治療心腦血管疾病的基石，由其引起的消化道損傷也是臨床上常見的棘手問題。替格瑞洛是繼氯吡格雷之后的新型防治心腦血管疾病藥物[1]，在ACS患者中，其心血管獲益大于氯吡格雷，但出血事件(包括消化道損傷出血)風(fēng)險(xiǎn)并不低于氯吡格雷。目前臨床上多聯(lián)合應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑(PPI)防治抗血小板藥物引起的消化道損傷，但研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)用PPI甚至PPI本身可能會(huì)增加心血管不良事件風(fēng)險(xiǎn)，且長期使用PPI可引起骨質(zhì)疏松、腸道菌群紊亂等不良反應(yīng)[7-9]。

本實(shí)驗(yàn)通過予實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍大鼠模型替格瑞洛干預(yù)，探討替格瑞洛對(duì)胃潰瘍的愈合是否有延遲作用及其可能機(jī)制。胃潰瘍的愈合是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，涉及壞死物質(zhì)的清除、肉芽組織生長、新生血管、纖維組織、瘢痕組織形成以及上皮修復(fù)等過程，黏膜缺失的填充、黏膜下組織結(jié)構(gòu)的重建是多種細(xì)胞、生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的結(jié)果。EGF是一種可促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和黏膜修復(fù)的生長因子，在維持胃腸道黏膜完整性方面具有重要作用，可通過促進(jìn)DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成加速損傷黏膜的修復(fù)，有研究表明潰瘍愈合質(zhì)量與EGF表達(dá)密切相關(guān)[10]。VEGF亦為促進(jìn)潰瘍愈合的重要因子，主要通過調(diào)節(jié)各種黏膜保護(hù)因子與損傷因子之間的平衡而參與黏膜修復(fù)[11]。一方面，VEGF可增加微血管通透性，通過稀釋胃內(nèi)有害物質(zhì)而發(fā)揮黏膜保護(hù)作用；另一方面，其還可刺激腺體和血管生成，從而促進(jìn)潰瘍愈合[12]。VEGF表達(dá)于多種人和動(dòng)物組織中，正常情況下表達(dá)水平較低，但在一些代謝旺盛、血供豐富的組織中往往呈較高水平表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，予胃潰瘍大鼠模型替格瑞洛干預(yù)后，胃黏膜大體和組織學(xué)表現(xiàn)均提示替格瑞洛可延遲潰瘍愈合，伴有潰瘍邊緣胃黏膜中EGF、VEGF表達(dá)降低，因此認(rèn)為替格瑞洛可通過抑制胃黏膜中的EGF、VEGF表達(dá)而導(dǎo)致潰瘍愈合延遲。

PCNA是一種僅在增殖細(xì)胞中表達(dá)、合成的酸性核蛋白，是評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)[13]。胃黏膜細(xì)胞的增殖能力是影響潰瘍愈合的重要因素，本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)替格瑞洛干預(yù)后，胃潰瘍大鼠模型潰瘍邊緣胃黏膜中PCNA表達(dá)顯著降低，由此推測替格瑞洛可能通過抑制潰瘍邊緣細(xì)胞增殖而延遲潰瘍愈合。正常情況下，組織器官中存在細(xì)胞增殖與凋亡的動(dòng)態(tài)平衡，該平衡的打破將導(dǎo)致疾病發(fā)生[14]，研究[15-17]顯示由多種原因引起的胃黏膜細(xì)胞凋亡是胃潰瘍的基本病理改變，但具體機(jī)制不明。為此，本研究以TUNEL法檢測了各組大鼠的潰瘍邊緣胃黏膜細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示替格瑞洛干預(yù)可使?jié)冞吘壩葛つぜ?xì)胞凋亡顯著增多，因此認(rèn)為促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞凋亡是替格瑞洛延遲潰瘍愈合的重要因素之一。

本實(shí)驗(yàn)中替格瑞洛高劑量組的胃黏膜大體和組織學(xué)損傷均重于低劑量組，潰瘍邊緣胃黏膜EGF、PCNA表達(dá)顯著低于低劑量組，但在VEGF表達(dá)和細(xì)胞凋亡方面與低劑量組相比無明顯差異，替格瑞洛延遲大鼠胃潰瘍愈合的作用是否呈劑量依賴性尚需進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，替格瑞洛可延遲大鼠胃潰瘍愈合，其機(jī)制可能是通過下調(diào)胃黏膜中的VEGF、EGF表達(dá)、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡而減緩潰瘍修復(fù)過程。本研究僅從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平初步探討了抗血小板藥物替格瑞洛對(duì)消化道的潛在損傷風(fēng)險(xiǎn)及其可能機(jī)制，確切機(jī)制仍有待后續(xù)更深入的基礎(chǔ)和臨床研究加以闡明。

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(2015-09-10收稿；2015-10-24修回)

Effect of Ticagrelor on Gastric Ulcer Healing in Rats and its Possible Mechanism

LIU Chenchen1,3,FAN Ye1,GUAN Yue1,JIANG Zongdan1,WANG Zhibing1,WANG Jinsong2,HUANG Wenbin2,ZHANG Zhenyu1.

1Department of Gastroenterology,2Department of Pathology,Affiliated Nanjing Hospital of Nanjing Medical University (Nanjing First Hospital),Nanjing (210006);3Department of Gastroenterology,Jining First People’s Hospital,Jining,Shandong Province

Ticagrelor;Stomach Ulcer;Vascular Endothelial Growth Factors;Epidermal Growth Factor;Cell Proliferation;Apoptosis

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.07.004

*Email:njliucc@163.com

#本文通信作者，Email:njzzy808@163.com