張桂枝，邢啟銀，靳雙星

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院畜牧工程系，河南 鄭州 450046）

復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對AA肉雞紅細(xì)胞免疫功能的影響

張桂枝，邢啟銀，靳雙星

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院畜牧工程系，河南 鄭州 450046）

為考察復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對AA肉雞免疫功能的影響，試驗(yàn)選取健康A(chǔ)A肉雞400只，隨機(jī)分成5組，每組設(shè)5個重復(fù)。試驗(yàn)雞在新城疫活疫苗（LaSota株）免疫時分別應(yīng)用復(fù)方中藥制劑和復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑連用7 d，并于14、28日齡分別進(jìn)行白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和測定T－淋巴細(xì)胞陽性率、免疫器官指數(shù)及新城疫抗體效價等免疫指標(biāo)。結(jié)果與空白對照組相比，復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑可顯著或極顯著提高雞的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量，T-淋巴細(xì)胞陽性率、免疫器官指數(shù)和新城疫抗體水平（P<0.05或P<0.01）;與藥物對照組相比，復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑中、高劑量組可顯著提高淋巴細(xì)胞數(shù)量、免疫器官指數(shù)和新城疫抗體水平（P<0.05），復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑用藥劑量可以減半使用。表明復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑能顯著地促進(jìn)肉雞淋巴細(xì)胞的增殖、免疫器官發(fā)育和疫苗抗體的產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。

復(fù)方中藥；發(fā)酵；肉雞；免疫

中草藥及其制劑因其具有安全、高效、低毒、價廉、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，在動物疫病防控中發(fā)揮著越來越大的作用[1-2]。近年來，通過微生物發(fā)酵手段炮制中藥的研究越來越受到重視，并取得了一定進(jìn)展。應(yīng)用微生態(tài)菌發(fā)酵中藥，可集發(fā)酵中藥制劑和微生態(tài)制劑雙重功能，其臨床效果優(yōu)于常規(guī)微生物發(fā)酵制劑和單一的中藥制劑，是現(xiàn)代生物技術(shù)和中藥研究的完美結(jié)合，成為中藥的研究與開發(fā)的新熱點(diǎn)。因此，本課題組成員根據(jù)中獸醫(yī)理論及養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)實(shí)際需要科學(xué)組方，研制出復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑。為進(jìn)一步闡明它增強(qiáng)免疫作用的機(jī)制，通過在飼料中添加不同劑量的復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑，測定AA肉雞的免疫細(xì)胞數(shù)量、免疫器官臟器指數(shù)、疫苗免疫后抗體效價等變化規(guī)律，探討復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對AA肉雞免疫功能的影響，旨在為臨床應(yīng)用及生產(chǎn)實(shí)踐提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)樣品復(fù)方中藥制劑：由連翹、黃芪、板藍(lán)根、茯苓、白術(shù)、枳實(shí)、山楂、甘草等8味中藥組成。分別于50℃～60℃下烘干2～3 h，粉碎，100%過80目篩，備用。復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑：取上述復(fù)方中藥制劑調(diào)整物料含水量為50%，pH值為6.0左右，使枯草芽孢桿菌：產(chǎn)朊假絲酵母：嗜酸乳桿菌=1∶1∶1，混勻后，按4%接種量接入飼料中，攪拌均勻后裝入不透氣的塑料袋中，壓實(shí)，封口，置于31℃的環(huán)境中培養(yǎng)72 h，烘干，即得。

1.2試驗(yàn)動物與設(shè)計(jì)1日齡健康A(chǔ)A肉雞，隔離飼養(yǎng)至7日齡，選取400只體重相近健康的肉仔雞，隨機(jī)分為5組，每組設(shè)5個重復(fù)，每個重復(fù)16只雞，分籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水，試驗(yàn)期間各組飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致。Ⅰ組為空白對照組，不用藥；Ⅱ組為復(fù)方中藥制劑組，飼料中添加1%復(fù)方中藥制劑，為藥物對照組；試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組，在飼料中分別添加0.5%、1.0%、1.5%的復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑。分別于免疫前1d用上述藥物，連續(xù)用藥1周。免疫程序：5組雞均在7日齡1.5倍量點(diǎn)眼滴鼻接種新城疫活疫苗（LaSota株）；21日齡3倍量飲水接種新城疫活疫苗（LaSota株）。

1.3主要試劑雞淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镏破酚邢薰旧a(chǎn)）。新城疫（ND）標(biāo)準(zhǔn)濃縮抗原、ND標(biāo)準(zhǔn)陽性血清（購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）。雞新城疫活疫苗（LaSota株）（齊魯動物保健品有限公司）。

1.4主要儀器顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)、微型振蕩器、96孔V型反應(yīng)板、微量移液器等。

1.5檢測指標(biāo)及測定方法

1.5.1白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)采用常規(guī)方法[3]。

1.5.2T-淋巴細(xì)胞陽性率的測定采用酸性α-醋酸萘酯酶（ANAE）染色法，計(jì)算T淋巴細(xì)胞ANAE陽性細(xì)胞百分率[4]。

1.5.3免疫器官指數(shù)測定于14、28日齡，每重復(fù)隨機(jī)抽取2只體重相近健康的AA肉雞，每個處理組共選10只雞，分別稱重，頸靜脈放血致死，迅速摘取胸腺、脾臟和腔上囊，進(jìn)行稱重并計(jì)算其免疫器官指數(shù)。免疫器官指數(shù)=免疫器官重量（g）/試驗(yàn)階段體重（kg）。

1.5.4抗體效價測定分別在7、14、28日齡，每重復(fù)隨機(jī)抽取2只體重相近健康的AA肉雞，每個處理組共選10只雞，采血，分離血清，采用微量紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗(yàn)對血清樣品進(jìn)行ND抗體測定，以完全抑制4個血凝單位抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為抗體效價，用nlg2來表示。

1.6統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0中One-Way ANOVA過程進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行Duncan′s多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié)果與分析

2.1復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對AA肉雞白細(xì)胞總數(shù)的影響由表1可知，復(fù)方中藥制劑組和復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑高、中、低劑量在14日齡、28日齡均能顯著提高其白細(xì)胞總數(shù)，即Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組與對照組比較差異顯著（P<0.05）；試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組與Ⅱ組比較差異不顯著（P>0.05）。試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ各組之間比較差異不顯著（P> 0.05）。說明日糧中添加復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑和復(fù)方中藥制劑均能顯著提高雞新城疫免疫期間的白細(xì)胞數(shù)量。

表1　復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對AA肉雞白細(xì)胞數(shù)量的影響（×109/L）

2.2復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對AA肉雞淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響表2結(jié)果表明，復(fù)方中藥制劑組和復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑高、中、低劑量在14日齡、28日齡均能顯著提高其淋巴細(xì)胞數(shù)量。藥物對照Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ與對照組比較差異顯著（P<0.05），試驗(yàn)Ⅳ、Ⅴ組與與對照組比較差異極顯著（P< 0.01），Ⅱ組、Ⅲ組與Ⅳ、Ⅴ組比較差異顯著（P< 0.05）；Ⅱ組與Ⅲ組以及Ⅳ與Ⅴ組之間比較差異不顯著（P>0.05）。說明免疫期間以1%劑量添加復(fù)方中藥制劑和以0.5%劑量添加復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑可顯著提高雞的淋巴細(xì)胞的數(shù)量；以1% 或1.5%劑量添加復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑能極顯著提高肉雞的淋巴細(xì)胞的數(shù)量。

表2　復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對AA肉雞淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響（×109/L）

2.3復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對AA肉雞T-淋巴細(xì)胞陽性率的影響由表3結(jié)果可知，復(fù)方中藥制劑組和復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑高、中、低劑量在14日齡、28日齡均能顯著提高其T淋巴細(xì)胞陽性率。藥物對照Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組與對照組比較差異顯著（P<0.05）；試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組與Ⅱ組比較差異不顯著（P>0.05）。試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ各組之間比較差異不顯著（P>0.05）。說明日糧中添加復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑和復(fù)方中藥制劑均能顯著提高雞新城疫免疫期間的T-淋巴細(xì)胞陽性率。

表3　復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對AA肉雞T-淋巴細(xì)胞陽性率的影響/%

2.4復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對AA肉雞免疫器官指數(shù)的影響由表4可知，14日齡，藥物對照Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組胸腺指數(shù)極顯著高于對照組（P<0.01）；Ⅳ、Ⅴ組腔上囊指數(shù)顯著高于對照組和Ⅱ、Ⅲ組（P<0.05）；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組脾臟指數(shù)顯著高于對照組（P<0.05），而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ之間差異不顯著（P>0.05）。28日齡，試驗(yàn)Ⅳ、Ⅴ組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)極顯著高于對照組（P<0.01），顯著高于Ⅱ、Ⅲ組（P<0.05），Ⅱ、Ⅲ組顯著高于對照組（P<0.05）。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組腔上囊指數(shù)顯著高于對照組（P<0.05）。說明日糧中添加復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑和復(fù)方中藥制劑均能顯著提高肉雞免疫器官指數(shù)。

表4　復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對AA肉雞免疫器官指數(shù)的影響?。╣/kg）

2.5復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對AA肉雞新城疫疫苗免疫效果的影響由表5可知，復(fù)方中藥制劑組和復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑高、中、低劑量組在7日齡免疫前新城疫抗體效價差異不顯著（P> 0.05），在14、28日齡均能顯著提高新城疫抗體效價。藥物對照Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組與對照組比較差異顯著（P<0.05）；14日齡時，試驗(yàn)Ⅴ組與藥物對照Ⅱ組比較差異顯著（P<0.05）。試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ各組之間比較差異不顯著（P>0.05）。說明日糧中添加復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑和復(fù)方中藥制劑均能顯著提高雞新城疫免疫期間的新城疫抗體效價。

表5　復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對AA肉雞新城疫疫苗免疫效果的影響?。╨g2）

3　討論

3.1本復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑是由連翹、板藍(lán)根、黃芪、甘草、茯苓、白術(shù)、枳實(shí)、山楂等中藥組成。黃芪、白術(shù)補(bǔ)中益氣，茯苓健脾利水，板藍(lán)根、連翹扶正祛邪，枳實(shí)破積行氣，山楂消食健脾，甘草調(diào)和諸藥。因此，此方具有補(bǔ)中益氣，健脾和胃，兼以清熱解毒、消導(dǎo)理氣的作用。發(fā)酵是中藥炮制的一種重要手段和方法，利用微生物強(qiáng)大的分解轉(zhuǎn)化物質(zhì)的能力，達(dá)到提高中藥藥效、改變藥性、擴(kuò)大適應(yīng)癥、降低毒副作用的目的。現(xiàn)代藥理研究表明，方中黃芪、板藍(lán)根、茯苓、白術(shù)、甘草及連翹等都具有免疫增強(qiáng)作用，能顯著促進(jìn)雞免疫器官的發(fā)育和免疫活性細(xì)胞的生成，并可增加血液中白細(xì)胞總數(shù)，促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬功能，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫[5-7]。

3.2外周血白細(xì)胞總數(shù)的變化反映了各種白細(xì)胞數(shù)量的變化，可以作為檢驗(yàn)機(jī)體免疫功能變化的一個重要指標(biāo)。細(xì)胞免疫應(yīng)答主要依賴于T淋巴細(xì)胞[4]。本研究結(jié)果表明，復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑在14、28日齡可以顯著或極顯著地提高肉雞血液中白細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞數(shù)量和T淋巴細(xì)胞陽性率，并維持在高水平。在復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對AA肉雞淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響研究中發(fā)現(xiàn)，日糧中添加1%復(fù)方中藥制劑組與1%和1.5%復(fù)方中藥發(fā)酵制劑組相比有顯著差異，與添加0.5%復(fù)方中藥發(fā)酵制劑組相當(dāng)，說明復(fù)方中藥制劑經(jīng)混菌發(fā)酵后其藥效明顯增強(qiáng)，這可能與有益微生物利用中藥成分作為營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長、繁殖和代謝，在此過程中分泌的蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶等胞外酶，使植物細(xì)胞壁破裂，從而利于中藥有效成分從胞內(nèi)釋放有關(guān)。研究結(jié)果證明，復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑具有顯著促進(jìn)免疫細(xì)胞的分裂、增殖、活化作用，能加速機(jī)體細(xì)胞免疫的發(fā)育和完善。

3.3Rivas等[8]認(rèn)為胸腺、脾臟、腔上囊的重量可用以評價雛雞的免疫狀態(tài)，其絕對重量和相對重量的變化可以反映機(jī)體內(nèi)細(xì)胞免疫和體液免疫機(jī)能。因此，通過測定免疫器官指數(shù)，可從生長發(fā)育角度評價機(jī)體免疫狀態(tài)和免疫能力[9]。試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加一定劑量的復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑可顯著提高肉雞胸腺、腔上囊和脾臟指數(shù)，這與謝紅兵[10]、葛劍[11]等報(bào)道的結(jié)果基本一致。說明本復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑可促進(jìn)肉雞淋巴器官的生長發(fā)育和迅速成熟。比較研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加1%復(fù)方中藥制劑與1%和1.5%復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑組相比有顯著差異，進(jìn)一步驗(yàn)證了發(fā)酵可促進(jìn)中藥藥效的增強(qiáng)。

3.4體液免疫是由抗原刺激B淋巴細(xì)胞，引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞活化、增殖與分化，形成漿細(xì)胞并產(chǎn)生抗體，抗體效價的變化反映機(jī)體的體液免疫狀態(tài)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑在不同程度上提高雞血清ND抗體效價，說明該復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑有明顯增強(qiáng)新城疫疫苗免疫效果的作用。

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S853.72

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0529-6005（2016）07-0052-03

2015-06-02

河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（142102110044）；河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（HUAHE2015003）

張桂枝（1970-），女，副教授，碩士，從事畜禽疫病防治的教學(xué)與科研工作，E-mail：zhangguizhi666@126.com

靳雙星，E-mail：jinshuangxing@126.com