吳 嘉 易鐵鋼（廣州中醫(yī)藥大學深圳附屬醫(yī)院腎病科廣東深圳518033）

黃芩素對阿霉素腎病大鼠腎小管上皮細胞凋亡的調節(jié)作用*

吳 嘉 易鐵鋼#
（廣州中醫(yī)藥大學深圳附屬醫(yī)院腎病科廣東深圳518033）

目的：探討黃芩素對阿霉素腎病大鼠腎小管上皮細胞凋亡的調節(jié)作用。方法：18只雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組（正常組，n=6）、阿霉素腎病組（模型組，n=6）和黃芩素治療組（治療組，n=6），模型組和治療組一次性尾靜脈注射阿霉素2.0 mg/kg誘導阿霉素腎病動物模型，正常組注射等量生理鹽水。造模后第1天開始，治療組予黃芩素300 mg/（kg·d）灌胃，正常組和模型組予等量蒸餾水灌胃，共治療8周。8周時留取各組大鼠24 h尿液標本及腎臟組織標本，使用TUNEL檢測腎小管上皮細胞凋亡，免疫組化檢測腎組織中caspase-3表達，western Blot方法檢測腎皮質中Bcl-2及caspase-3蛋白水平。結果：與正常組比較，模型組24 h尿蛋白定量明顯升高（P＜0.05），腎小管上皮細胞凋亡數(shù)量明顯增加（P＜0.05），腎皮質中caspase-3蛋白水平明顯增加（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平明顯下降（P＜0.05）。與模型組比較，治療組24 h尿蛋白定量明顯下降（P＜0.05），TUNEL陽性腎小管上皮細胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05），腎皮質中caspase-3蛋白水平明顯下降（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平明顯增加（P＜0.05）。結論：黃芩素對阿霉素腎病具有一定的保護作用，其作用機制可能與調節(jié)腎小管上皮細胞凋亡有關。

阿霉素腎??；黃芩素；腎小管上皮細胞凋亡；caspase-3；Bcl-2

阿霉素腎?。ˋdriamycin Nephropathy，AN）動物模型最早由Bertani等于1982年制作成功。其臨床特點為大量蛋白尿，病理特點類似微小病變，早期僅表現(xiàn)為電鏡下足突融合，后期逐漸出現(xiàn)腎小球硬化及腎小管間質纖維化［1］。作為典型的足細胞損傷模型，許多因素參與AN發(fā)生發(fā)展［2］，其中腎小管上皮細胞（Tubular Epithelial Cells，TECs）凋亡是導致腎小管損傷進而走向小管間質纖維化的重要因素［3］。中藥單體黃芩素具有調節(jié)細胞凋亡和腎臟保護作用［4～5］。本研究擬從TECs凋亡角度探討黃芩素對AN的保護作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物18只雄性Wistar大鼠，體重170～220 g，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，適應性喂養(yǎng)1周，實驗期間自由飲水、攝食。

1.1.2實驗用藥、試劑及主要儀器阿霉素（Sigma Aldrich，St.Louis，MI，USA），黃芩素（南京崇原生物有限公司），Bcl-2一抗（Sigma Aldrich，St.Louis，MI，USA），western blot濃度為1∶500，caspase-3一抗（Abcam，Cambridge，UK），western blot濃度為1∶200，免疫組化濃度為1∶20，二抗（Cell signaling Tec，MA，USA），免疫組化試劑盒（Maixin-Bio，F(xiàn)uzhou，China），TUNEL檢測試劑盒（德國Merck），大鼠代謝籠（Tecniplast S.p.a，Buguggiate，Italy），熒光顯微鏡（Nikon Corporation，Tokyo，Japan），垂直電泳儀（Bio-Rad，Hercules，CA，USA），轉膜儀（Bio-Rad，Hercules，CA，USA），羅氏全自動生化分析儀。

1.2方法

1.2.1動物模型制作及干預將18只雄性Wistar大鼠隨機分為正常組（n=6）、模型組（n=6）和治療組（n=6），模型組和治療組一次性尾靜脈注射阿霉素2.0 mg/kg，正常組注射等量生理鹽水。造模后第1天開始，治療組予黃芩素300 mg/（kg·d）灌胃，正常組和模型組予等量蒸餾水灌胃，共治療8周。

1.2.2標本采集與保存治療8周后，使用大鼠代謝籠收集各組24 h尿液標本。腎臟組織標本采集步驟如下：10％水合氯醛按35 mg/100 g腹腔注射麻醉，沿腹正中線剖開腹腔，摘除腎臟，切取一半左腎用10％福爾馬林固定，經(jīng)脫水，透明，石蠟包埋，切片4 μm，行TUNEL及檢測免疫組織化學染色。剩余腎臟組織分離皮髓質后凍存于-80℃冰箱，以備Western Blot檢測。

1.2.3標本測定24 h尿蛋白定量（免疫比濁法），使用羅氏全自動生化分析儀。使用TUNEL檢測TECs凋亡，免疫組化檢測腎皮質中caspase-3表達分布，Western blot方法檢測腎皮質中caspase-3及Bcl-2蛋白水平。

2結果

2.124 h尿蛋白定量與正常組比較，模型組24 h尿蛋白定量明顯升高（P＜0.05），治療組經(jīng)黃芩素干預8周后明顯下降（P＜0.05）。見圖1。

圖1　各組大鼠第8周時24h尿蛋白定量

2.2TUNEL陽性TECs數(shù)量與正常組比較，模型組TUNEL陽性TECs數(shù)量明顯增加（P＜0.05），治療組較模型組明顯減少（P＜0.05）。見圖2。

圖2　各組大鼠8周時高倍鏡視野下TECs凋亡計數(shù)

2.3腎組織中caspase-3表達分布免疫組化染色結果顯示腎組織中caspase-3表達分布主要集中在腎小管，腎小球中也有少量表達，與TUNEL檢測結果基本一致。見圖3。

圖3　各組大鼠8周時腎組織caspase-3免疫組化染色

2.4腎皮質中caspase-3和Bcl-2蛋白水平Western blot結果顯示與正常組比較，模型組腎皮質中caspase-3蛋白水平明顯增加（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平明顯下降（P＜0.05），與模型組比較，治療組腎皮質中caspase-3蛋白水平明顯下降（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平明顯增加（P＜0.05）。見圖4。

圖48　周時各組大鼠腎皮質caspase-3及bcl-2蛋白水平

3 討論

細胞凋亡是細胞在一定信號刺激下出現(xiàn)的自主性、程序性細胞死亡，其過程受到嚴格的基因調控，在正常生理過程或病理條件下均可發(fā)生，是機體維持細胞數(shù)量平衡和清除異常及危險細胞的重要機制［6］。TECs凋亡在缺血性腎損傷、藥物性腎損害、梗阻性腎臟病中均起到重要作用。慢性腎病狀態(tài)下，持續(xù)蛋白尿所致TECs凋亡與小管萎縮程度及腎功能損害呈明顯正相關［7］。

作為細胞凋亡的重要調節(jié)蛋白，caspase-3與Bcl-2的表達與TECs凋亡密切相關［8］。AN進展至8周時，TUNEL檢測結果顯示模型組大鼠TECs凋亡數(shù)量明顯增加，這表明TECs凋亡參與了AN腎病的進展。免疫組化染色顯示caspase-3主要分布于腎小管，腎小球中僅有少量表達，與TUNEL檢測結果基本一致。腎皮質中caspase-3蛋白水平表達上調則進一步證實了腎組織中細胞凋亡的發(fā)生。腎皮質中Bcl-2蛋白水平表達下調則提示線粒體凋亡通路可能參與到TECs細胞凋亡進程。經(jīng)黃

芩素干預8周后，治療組24 h尿蛋白定量明顯下降，表明黃芩素對AN有一定的保護作用。治療組TECs凋亡減少，caspase-3蛋白水平下調，Bcl-2蛋白水平上調，提示黃芩素可能通過Bcl-2、caspase-3起到調節(jié)細胞凋亡的作用，但其具體的作用機制尚需進一步探討。綜上所述，本研究初步證實了黃芩素對AN具有一定的保護作用，其作用機制可能與調節(jié)TECs凋亡有關。

［1］Bertani T，Poggi A，Pozzoni R，et al.Adriamycin-induced nephrotic syndrome in rats：sequence of pathologic events［J］.Lab Invest，1982，46（1）：16-23

［2］Lee VW，Harris DC.Adriamycin nephropathy：a model of focal segmental glomerulosclerosis［J］.Nephrology（Carlton），2011，16（1）：30-38

［3］OhseT，InagiR，TanakaT，etal.Albumininducesendoplasmic reticulum stress and apoptosis in renal proximal tubular cells［J］. Kidney Int，2006，70（8）：1447-1455

［4］Lin M，Li L，Li L，et al.The protective effect of baicalin against renalischemia-reperfusion injury through inhibition of inflammation and apoptosis［J］.BMC Complement Altern Med，2014，14（1）：1-9

［5］Lee EK，Kim JM，Choi J，et al.Modulation of NF-kB and FOXOs by baicalein attenuates the radiation-induced inflammatory process in mouse kidney［J］.Free Radic Res，2011，45（5）：507-517

［6］Favaloro B，Allocati N，Graziano V，et al.Role of apoptosis in disease ［J］.Aging（Albany NY），2012，4（5）：330-349

［7］Erkan E，Garcia CD，Patterson LT，et al.Induction of renal tubular cell apoptosis in focal segmental glomerulosclerosis：roles of proteinuria and Fas-dependent pathways［J］.J Am Soc Nephrol，2005，16（2）：398-407

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R692

Bdoi：10.13638/j.issn.1671-4040.2016.04.044

廣東省自然科學基金（編號：2015A030313883）；廣東省深圳市科技計劃項目（編號：JCYJ20140408152909284，JCYJ20150401163247228）；廣東省深圳市衛(wèi)生計生系統(tǒng)科研項目（編號：201402079）
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易鐵鋼，E-mail：KOKYO_82@163.COM

（2016-03-18）