夏蓉蓉，陳梅玲，張瑞秋，柯許彬，張 亮

(南京師范大學(xué)泰州學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇泰州 225300)

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鋁脅迫下外生菌根真菌對(duì)土壤無機(jī)磷的溶解釋放

夏蓉蓉，陳梅玲，張瑞秋，柯許彬，張 亮*

(南京師范大學(xué)泰州學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇泰州 225300)

[目的]研究鋁脅迫下外生菌根真菌對(duì)土壤無機(jī)磷的溶解釋放。[方法]鋁脅迫下，以彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius，編號(hào)Pt)和松乳菇(Lactariusdelicious，編號(hào)Ld)為供試菌株，土壤為唯一磷源，采用液體培養(yǎng)試驗(yàn)研究菌絲生長情況，以及對(duì)土壤無機(jī)磷的活化。[結(jié)果]在鋁脅迫下，2株外生菌根真菌的生物量隨著鋁離子濃度的升高，表現(xiàn)為先增高后降低的趨勢，其中，在0～2.0 mmol/L鋁離子濃度下，Pt的生物量均大于Ld，說明Pt的抗鋁毒能力強(qiáng)于Ld。此外，pH在鋁離子脅迫下顯著下降，2株外生菌根真菌不同程度地活化土壤中無機(jī)磷。[結(jié)論]外生菌根真菌的抗鋁和溶磷能力與其分泌的氫離子和有機(jī)酸有關(guān)。

鋁；外生菌根真菌；酸性土壤；磷

鋁元素是土壤中含量最高的金屬元素，但并非植物生長所必需的元素。我國南方很多地區(qū)受到酸雨的影響，導(dǎo)致土壤中鋁離子的溶出，形成鋁毒[1]。而南方地區(qū)森林土壤礦質(zhì)元素缺乏嚴(yán)重，加之森林土壤一般不施肥，導(dǎo)致森林生態(tài)系統(tǒng)極不穩(wěn)定，酸雨加重了土壤酸化和毒害，造成很多林地成片枯萎凋亡[2]。

外生菌根真菌作為森林生態(tài)系統(tǒng)的一部分，與多數(shù)木本植物形成菌根共生體后，能增強(qiáng)植物根系對(duì)難溶磷鉀的溶解吸收，從而促進(jìn)植物的生長[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在重金屬脅迫下，外生菌根真菌能積累重金屬，增強(qiáng)植物的抗逆性，緩解重金屬對(duì)植物的迫害[4]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，外生菌根真菌作為根系微生物，能向植物根系周圍分泌多種有機(jī)酸，包括小分子的草酸、乙酸、酒石酸等，這些有機(jī)酸能電離出氫離子，來溶解難溶性的磷酸鈣鹽；高分子有機(jī)酸能與金屬離子形成穩(wěn)定絡(luò)合物，從而將磷酸根釋放到土壤中[5-6]。目前，對(duì)外生菌根真菌的研究主要集中在菌根化苗木的生長和抗脅迫環(huán)境，外生菌根真菌在金屬脅迫和難溶性磷的活化釋放研究較少。筆者以南方地區(qū)森林土壤——低磷黃紅壤為供試土壤，研究在鋁脅迫下，外生菌根真菌對(duì)土壤無機(jī)磷的溶解釋放。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1外生菌根真菌。從南京師范大學(xué)泰州學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室取2株外生菌根真菌，分別為彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius，編號(hào)Pt)和乳菇(Lactariusdelicious，編號(hào)Ld)。采用無磷源的Pachlewsk固體培養(yǎng)基，25 ℃下培養(yǎng)14 d備用。

1.1.2培養(yǎng)基。培養(yǎng)基組成：0.5 g/L酒石酸銨，0.55 g/L KCl，0.5 g/L MgSO4，20 g/L 葡萄糖，20 g/L瓊脂，0.1 g/L維生素B1，1.0 ml/L微量元素混合液(1 L含8.45 mg H3BO3、5 mg MnSO4、6 mg FeSO4、0.625 mg CuSO4、2.77 mg ZnCl2和0.27 mg(NH4)2MoO4)，瓊脂15～20 g；搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)全部溶解，調(diào)pH至5.5，用去離子水定容至1 L，并在121 ℃高壓下蒸汽滅菌30 min。

1.1.3土壤樣品。供試土壤為酸性黃紅壤，采自浙江安吉藏龍百瀑景區(qū)馬尾松林下的底層土壤。土壤理化指標(biāo)：pH 4.25，有機(jī)質(zhì)20.5 g/kg，全氮1.07 g/kg，全磷0.55 g/kg，有效磷22.9 mg/kg。風(fēng)干土壤，磨細(xì)過100目篩，取1.000 0 g土壤置于兩端開口的直徑1 cm的塑料管中部，然后兩端塞入玻璃纖維，將土壤夾在中間，再用孔徑0.22 μm的微孔濾膜密封兩端，121 ℃蒸汽滅菌150 min。在培養(yǎng)外生菌根真菌時(shí)，將盛有土壤的塑料管放入液體培養(yǎng)基中，水分子、無機(jī)離子和有機(jī)酸等均可自由進(jìn)出，但土壤不會(huì)穿過濾膜而進(jìn)入溶液。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別配制鋁離子濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的無磷Pachlewsk液體培養(yǎng)基，pH 4.25。分別取上述溶液20 mL加入150 mL三角瓶中，在每個(gè)三角瓶中加入1個(gè)裝有土壤的滅菌塑料管，封口，蒸汽滅菌((121±1)℃，30 min)，冷卻；每瓶分別接入直徑6 mm的瓊脂菌種2塊，以不接種但加入1個(gè)土壤塑料管的液體培養(yǎng)基為對(duì)照，其余接種處理，試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)處理設(shè)5次重復(fù)。25 ℃暗箱靜止培養(yǎng)14 d。

1.3測定項(xiàng)目與方法培養(yǎng)結(jié)束后，過濾菌絲，收集濾液。用數(shù)字酸度計(jì)測定濾液pH變化；菌絲干燥后測定生物量；取出塑料管中的土壤，自然風(fēng)干，土壤無機(jī)磷組分測定采用文獻(xiàn)[7]的方法：1 mol/L NH4Cl浸提疏松態(tài)磷，0.5 mol/L NH4F浸提鋁磷(Al-P)，0.1 mol/L NaOH浸提鐵磷(Fe-P)，0.3 mol/L檸檬酸鈉+1.0 g Na2S2O4+0.5 mol/L NaOH浸提閉蓄態(tài)磷(O-P)，0.5 mol/L(1/2H2SO4)浸提鈣磷(Ca-P)。

1.4數(shù)據(jù)處理用Excel 2007對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同處理間的差異顯著性用單因素方差分析進(jìn)行比較。

2　結(jié)果與分析

2.1鋁對(duì)外生菌根真菌生物量的影響由圖1可知，隨著鋁離子濃度的升高，2株外生菌根真菌的生物量均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢。其中，菌株P(guān)t的生物量均在鋁離子濃度1 mmol/L時(shí)達(dá)到最大，后隨著鋁離子濃度的升高，生物量降低，而菌株Ld在0.5 mmol/L時(shí)達(dá)到最大；且在試驗(yàn)所設(shè)鋁離子濃度范圍內(nèi)，Pt的生物量均大于Ld。說明Pt對(duì)鋁離子的敏感度小于Ld。

圖1　不同濃度鋁離子對(duì)外生菌根真菌生物量的影響Fig.1　Effects of Al3+ concentration on the biomass of ectomycorrhizal fungi

2.2鋁脅迫下外生菌根真菌培養(yǎng)基中pH的變化由圖2可知，培養(yǎng)14 d后，2株外生菌根真菌均顯著降低培養(yǎng)基中的pH，且隨著鋁離子濃度的增加，降低效果越顯著。其中，Ld菌株在鋁離子濃度為2.0 mmol/L時(shí)，降幅最大，與對(duì)照(CK)相比，pH降低1.02。同時(shí)，在試驗(yàn)所設(shè)鋁離子濃度范圍內(nèi)，菌株Ld的降幅均大于菌株P(guān)t。

注：CK為不接種，鋁濃度為0 mmol/L。Note：CK means the medium was not inoculated，and Al3+ concentration was 0 mmol/L.圖2　培養(yǎng)基中pH的變化Fig.2　Changes of pH in liquid culture mediums

2.3鋁脅迫下外生菌根真菌對(duì)土壤各組分無機(jī)磷含量的影響由表1可知，在液體培養(yǎng)基中接種外生菌根真菌，土壤鋁磷、鐵磷、鈣磷和閉蓄態(tài)磷均不同程度地降低。其中，2株外生菌根真菌在試驗(yàn)所設(shè)鋁離子濃度下均顯著降低土壤中的鋁磷、鐵磷和鈣磷。除菌株Ld在鋁濃度為0 mmol/L外，2株外生菌根真菌顯著降低土壤中的閉蓄態(tài)磷。從土壤無機(jī)磷總量看，2株外生菌根真菌在試驗(yàn)所設(shè)鋁離子濃度下均顯著降低土壤中的無機(jī)磷總量，降幅為2.87%～9.54%。此外，菌株不同，土壤無機(jī)磷各組分的降幅也不同。

表1　土壤中無機(jī)磷組分的變化

注：同列不同小寫字母表示不同濃度間差異顯著(P<0.05)。

Note：Different letters in the same column stand for significant difference at 0.05 level.

3　結(jié)論與討論

該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2株外生菌根真菌在不同鋁離子濃度下均能活化土壤中無機(jī)磷組分，菌株P(guān)t的活化能力略強(qiáng)于Ld；同時(shí)2株外生菌根真菌隨著鋁離子濃度的升高，菌絲的磷吸收量表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，說明低濃度的鋁離子對(duì)菌絲生長是有益的，可以促進(jìn)菌絲從低磷環(huán)境下吸收養(yǎng)分。當(dāng)鋁離子濃度超過菌絲的耐受性后，將不利于外生菌根真菌的生長。因此，篩選出既有抗鋁作用又耐低磷(活化能力強(qiáng))的優(yōu)良菌株顯得尤為重要。

該研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中的pH在鋁離子的脅迫下顯著下降，其中，Ld菌株在鋁離子濃度為2.0 mmol/L時(shí)，降幅最大，與對(duì)照(CK)相比，pH降低了1.02，這說明2株外生菌根真菌通過向環(huán)境中釋放氫離子，活化難溶性磷酸鹽。在我國南方大部分地區(qū)由于受到環(huán)境的污染，土壤酸化嚴(yán)重，伴隨著鋁離子在土壤中的大量溶出，加上森林土壤養(yǎng)分的貧瘠，使外生菌根真菌生長受到抑制，進(jìn)而樹木缺乏養(yǎng)分供給[8-10]。該研究發(fā)現(xiàn)，外生菌根真菌Pt具有較強(qiáng)的抗鋁和耐低磷環(huán)境的能力。因此，篩選出優(yōu)良的外生菌根真菌，研究其耐脅迫環(huán)境的機(jī)理，并將其應(yīng)用于森林退化修復(fù)中意義重大。

[1] 辜夕容，黃建國.鋁對(duì)外生菌根真菌草酸分泌及磷、鉀、鋁吸收的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，20(2)：357-363.

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Dissolution and Release of Inorganic Phosphorus from Soil by Ectomycorrhizal Fungi under Aluminum Stress

XIA Rong-rong, CHEN Mei-ling, ZHANG Rui-qiu, ZHANG Liang*et al

(School of Chemistry and Bioengineering, Taizhou College, Nanjing Normal University, Taizhou, Jiangsu 225300)

[Objective] To study the dissolution and release of inorganic phosphorus from soil by ectomycorrhizal fungi under aluminum stress. [Method]Pisolithustinctorius(Pt) andLactariusdelicious(Ld) were cultured in liquid Pachlewsk medium with soil as the source of phosphorus (P) under aluminum stress to study the fungal growth, and changes of soil inorganic P were measured to study P mobilization from soil by ectomycorrhizal fungi (ECMF). [Result] The fungal growth first increased and then decreased with the increase of aluminum concentration. When aluminum concentration varied from 0 to 2.0 mmol/L, the biomass of Pt was higher than that of Ld, showing that the resistance of Pt to aluminum toxicity was stronger than that of Ld. In addition, the pH of culture mediums decreased significantly, and the soil inorganic P was mobilized by ECMF at different levels. [Conclusion] The ability of ECMF to resist aluminum and mobilize P is related to hydrogen ions and organic acids secreted by ECMF.

Aluminum; Ectomycorrhizal fungi; Acid soil; Phosphorus

江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目“鋁脅迫下外生菌根真菌對(duì)土壤無機(jī)磷的活化作用”(201513843015Y)；泰州市科技支撐計(jì)劃(社會(huì)發(fā)展)項(xiàng)目“農(nóng)作物秸稈高溫堆肥生產(chǎn)有機(jī)肥”(TS018)；泰州市科技支撐計(jì)劃(社會(huì)發(fā)展)項(xiàng)目(TS201516)。

夏蓉蓉(1994- )，女，江蘇泰州人，本科生，專業(yè)：制藥工程。*通訊作者，講師，碩士，從事農(nóng)業(yè)資源微生物研究。

2016-05-26

S 718.81

A

0517-6611(2016)19-143-02