李笑笑， 張文斌， 楊瑞金

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)

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超聲處理核桃仁及其提取物的抗氧化性分析

李笑笑， 張文斌*， 楊瑞金

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)

[目的]提取活性較高的核桃多酚，提高核桃的利用價值。[方法]采用添加0.05 mol/L鹽酸的70%乙醇溶液超聲輔助的方法處理核桃仁，F(xiàn)olin-Ciocalteau法測定總酚含量，并測定其清除自由基能力及鐵離子還原能力表征抗氧化活性。[結(jié)果]4次超聲提取(65 ℃, 10 min)的核桃多酚提取液多酚含量為(12.03±0.16) mg/g，核桃仁中的多酚殘留量為0.38 mg/g，低于堿處理后的核桃仁多酚殘留量。此外，核桃多酚提取物在清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基能力及鐵離子還原能力均高于叔丁基對苯二酚(TBHQ)、VC和VE。[結(jié)論]酸化乙醇超聲處理核桃仁不僅可以有效去除核桃多酚，還為食品工業(yè)提供了高活性的天然抗氧化劑。

核桃仁；多酚；抗氧化活性；超聲提取

1材料與方法

1.1材料與試劑核桃仁，烏魯木齊亞心紅商貿(mào)有限公司； 95%乙醇、鹽酸、丙酮、無水碳酸鈉、吐溫-80、氯仿、三氯乙酸、三氯化鐵、鐵氰化鉀、過硫酸鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉等，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Folin-Ciocalteau試劑、叔丁基對苯二酚(TBHQ)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、胡蘿卜素、VE，Sigma公司。

1.2儀器設(shè)備 RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，廣州儀科實驗技術(shù)有限公司；101-1-B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；KQ5200DE型超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；SZC-101型脂肪測定儀，上海纖檢儀器有限公司；TGL-16M型冷凍離心機，上海盧液離心機儀器有限公司；A11型研磨機，德國IKA公司；UV-1100紫外/可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；DELTA320型pH計，上海梅特勒公司；M5型酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司。

1.3方法

1.3.1核桃種皮多酚的超聲提取。挑選大小均一、顆粒飽滿的核桃仁，按照1∶5的料液比，將核桃仁放入用0.05 mol/L鹽酸酸化的70%乙醇溶液中，65 ℃條件下，超聲提取10 min，將提取液取出后迅速冷卻，再重復(fù)提取3次，將4次的提取液合并，過濾2次后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2堿脫皮方法。根據(jù)劉淼的方法[10]略作修改，按照1∶5的料液比將干凈的核桃仁加入到濃度0.9%的氫氧化鈉溶液中，浸泡溫度78 ℃，期間不斷攪拌，浸泡5 min后取出并迅速用流水沖洗干凈。

1.3.3核桃仁殘留多酚的提取。準(zhǔn)確稱取2 g分別經(jīng)上述2種方法處理的核桃脫脂樣品于離心管中，加入20 mL的80%丙酮，將管蓋擰緊并混勻，然后超聲30 min，超聲期間加入冰塊保持低溫，每隔2 min取出渦旋混勻，超聲之后6 000 r/min離心10 min，收集上清液，所有提取過程再重復(fù)2次，合并3次的提取液，45 ℃旋蒸后冷凍干燥，粉末用70%甲醇定容至2 mL，保存于-80 ℃待用。每個樣品共提取3份[11]。

1.3.4核桃多酚含量的測定[12]。采用Folin-Ciocalteu法進行測定，移取 100 μL核桃多酚提取液于 10 mL 比色管中，加入 500 μL Folin-Ciocalteu試劑及 2.5 mL Na2CO3溶液(20%，W/V)，蒸餾水定容。室溫避光靜置 1 h 后測定反應(yīng)液在波長725 nm 處的吸光值。以同體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液代替樣品溶液進行測定，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終結(jié)果表示為 1 g 核桃仁相當(dāng)于沒食子酸的毫克數(shù)[(mg(沒食子酸)/g(核桃仁)]。

1.3.5DPPH自由基清除能力的測定[13-14]。將處理過的核桃多酚提取液樣品，以TBHQ、VC、VE為對照，用95%乙醇配制成質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100 μg/ mL的溶液。取上述各溶液0.1 mL，加入3.9 mL 60 μmol/L DPPH(乙醇配制)，充分混勻，37 ℃保溫60 min。以95%乙醇為空白對照，在波長517 nm處測定其吸光值，樣品吸光值記做AC，空白對照記做Ai，求清除率(RSADPPH)。

1.3.6ABTS自由基清除能力的測定[15]。取7 mmol/L ABTS乙醇溶液50 mL和5 mmol/L過硫酸鉀乙醇溶液50 mL，混合，室溫避光靜置12 h，作為反應(yīng)貯備液，然后用70%乙醇稀釋，使其吸光值在波長734 nm處為0.70±0.02；將處理過的核桃多酚提取液樣品，以TBHQ、VC、VE為對照，用70%乙醇配成濃度分別為20、40、60、80、100 μg/mL的溶液。取各樣品溶液0.1 mL，加入3.9 mL反應(yīng)貯備，混合，室溫避光6 min，在734 nm波長處測其吸光值(As)，以70%乙醇溶液作為對照(AC)，則其ABTS的清除率(RSAABTS)。

1.3.7鐵離子還原能力的測定[16]。將處理過的核桃多酚提取液樣品，用蒸餾水配成濃度分別為20、40、60、80、100 μg/ mL 的溶液。各取2 mL，加入2 mL 0.2 mol/mL pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液和2 mL 1%鐵氰化鉀溶液，充分混勻，50 ℃水浴20 min；取出待測樣，加入2 mL 10%三氯乙酸溶液；得到的反應(yīng)混合液，于3 000 r/min離心10 min，取上清液4 mL，加入4 mL蒸餾水和0.8 mL 0.1%三氯化鐵溶液，振蕩混合均勻，在700 nm波長處測定其吸光值。

1.3.8抗脂質(zhì)過氧化能力的測定。取0.2%β-胡蘿卜素氯仿溶液0.5 mL、10%亞油酸氯仿溶液0.2 mL、20%吐溫-80氯仿溶液10 mL，混合均勻，40 ℃旋干后，加入100 mL去離子水，劇烈振蕩5 min，形成乳狀液；取45 mL上述乳狀液和4 mL 0.2 mol/L pH 6.84磷酸緩沖液充分混合后，取200 μL，加入10 μL 60 μg/mL樣品溶液，混勻， 放入酶標(biāo)儀中，37 ℃恒溫孵育1 h，并在470 nm波長處測其吸收值，每隔10 min讀數(shù)1次。

試驗以純乙醇代替樣品溶液作為空白對照組，E0和C0分別表示反應(yīng)起始(0 min)時樣品組和對照組的吸光值，Et和Ct分別代表樣品組在任意間隔為10 min時刻的吸光值，計算其抗氧化能力(AA)。

2　結(jié)果與分析

2.1不同處理方法對核桃種皮顏色的影響從圖1可以明顯看出，經(jīng)過4次酸化乙醇超聲處理之后，在烘干之前，核桃種皮顏色基本接近于核桃仁，非常白凈，烘干之后顏色也較堿處理之后的淺。核桃多酚在0.9%氫氧化鈉溶液中呈深褐色，用堿處理之后，雖然立即用大量的清水處理，仍然會有部分殘留，烘干之后由于氧化呈現(xiàn)如圖1～4所顯示的顏色，而這部分已經(jīng)褐變氧化的核桃多酚會對后續(xù)制備的核桃乳的色澤產(chǎn)生影響。

注：1.核桃原料；2.酸化乙醇超聲提取4次后未烘干的核桃仁；3.酸化乙醇超聲提取4次烘干后的核桃仁；4.堿液脫皮處理烘干后的核桃仁?！ote:1.Raw material of walnut; 2.Walnut kernels without baking after four times of acidic ethanol ultrasonic extraction; 3.Walnut kernels with baking after four times of acidic ethanol ultrasonic extraction; 4.Walnut kernels with baking after alkali peeling treatment.圖1　不同處理方法及階段的核桃仁顏色Fig.1　Colors of walnut kernels by different treatment methods

2.2不同處理方法對核桃總酚含量的影響由圖2可見，核桃多酚在堿性條件下是不穩(wěn)定的，在酸性和中性條件下非常穩(wěn)定。堿處理之后的，絕大部分的核桃多酚都已經(jīng)溶解在堿液中，但是測定出總酚含量只有0.51 mg/g。酸化乙醇提取的多酚含量為14.85 mg/g，提取率為96.6%，遠高于堿法提取的，且前者在多酚殘留量上也稍微低于后者。

圖2　不同處理方式的總酚含量Fig.2　The total phenol contents in different treatments

2.3對DPPH自由基清除能力由于DPPH自由基是一個穩(wěn)定的自由基，且該分析方法簡單快速，自1958年被提出以來[17]，便廣泛被國內(nèi)外用于定量測定生物試樣和食品的抗氧化能力[18]。DPPH自由基醇溶液為紫色，在有自由基清除劑存在時，DPPH上的單電子會因為配對而使溶液的顏色漸漸變淺，特征吸收波長為517 nm。

圖3　不同濃度的核桃多酚、TBHQ、VC、VE溶液對DPPH自由基的清除效果Fig.3　DPPH radical scavenging ability of walnut polyphenols, TBHQ, VC and VE at different concentrations

由圖3可知，清除DPPH自由基能力由強到弱的順序為核桃多酚>TBHQ≈VC>VE。4種物質(zhì)清除DPPH自由基的能力均與濃度成正比，酸化乙醇提取的核桃多酚表現(xiàn)出較高的清除自由基的能力。濃度20 μg/mL核桃多酚清除DPPH自由基的能力高于100 μg/mL的VE，與60 μg/mL的TBHQ和VC相當(dāng)。核桃多酚、TBHQ、VC、VE對DPPH自由基的半抑制濃度(IC50)分別為59.91、136.60、165.02、223.76 μg/mL。2.4對ABTS自由基清除能力ABTS法是用來測定總抗氧化能力的方法，在氧化劑的作用下，ABTS會被氧化成綠色的ABTS·+，而抗氧化劑與該自由基配對后，溶液顏色變淺，在波長734 nm下的吸光值下降，故可以采用比色法的測定結(jié)果來衡量自由基清除情況，從而評價抗氧化劑的抗氧化效果。

由圖4可得，清除ABTS自由基能力由強到弱的順序為核桃多酚>TBHQ≈VC>VE，與DPPH測定的排序結(jié)果一致，4種物質(zhì)清除ABTS自由基的能力與濃度成正比，酸化乙醇提取的核桃多酚仍然表現(xiàn)出最高的清除自由基的能力，不同濃度的VE清除ABTS自由基的能力變化不大。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，各個抗氧化劑之間的抗氧化能力差異增大。核桃多酚、TBHQ、VC、VE對ABTS自由基的半抑制濃度(IC50)分別為55.82、87.84、93.77、185.93 μg/mL。

圖4　不同濃度的核桃多酚、TBHQ、VC、VE溶液對ABTS自由基的清除效果Fig.4　ABTS radical scavenging ability of walnut polyphenols, TBHQ, VC and VE at different concentrations

2.5對鐵離子的還原能力該方法主要是測定抗氧化劑的還原力[19]，還原力強，則電子供應(yīng)能力強。還原力的高低可間接反映抗氧化能力強弱。

由圖5可知，3種樣品還原力的變化趨勢與代表總抗氧化能力的ABTS指標(biāo)的變化趨勢一致，還原力強弱順序為核桃多酚>VC>TBHQ。在此體系中，TBHQ的抗氧化能力稍微低于VC，可能是因為反應(yīng)體系的差異。在鐵離子的還原力測定中，以蒸餾水為溶劑，而TBHQ在水中的溶解度較小，隨著濃度的增大，TBHQ與VC的差異越來越大。核桃多酚則隨著濃度的增大，還原力極速增加，說明核桃多酚在水溶性體系中能表現(xiàn)出更好的抗氧化效果。

圖5　不同濃度的核桃多酚、TBHQ、VC溶液的鐵還原力結(jié)果Fig.5　 Ferric reducing power of walnut polyphenols, TBHQ, and VC at different concentrations

2.6抗油脂過氧化能力β-胡蘿卜素漂白測試體系的原理是，在一定溫度下，亞油酸自動氧化產(chǎn)生自由基，使得β-胡蘿卜素褪色，在波長470 nm下，特征吸收減弱。而抗氧化劑可以清除自由基，從而保護β-胡蘿卜素不褪色，起到保護作用。

圖6顯示，抗氧化活性順序為TBHQ>VE≈核桃多酚。這與清除DPPH、ABTS自由基不同，核桃多酚表現(xiàn)出了較差的抗氧化活性。說明由于核桃多酚的極性較強[20]，不太適用于抗油脂氧化。隨著時間的推移，3種抗氧化劑抗氧化能力在0～20 min內(nèi)均呈現(xiàn)下降趨勢，20～60 min又開始升高，這可以用自由基產(chǎn)生的動力學(xué)理論來解釋。自由基產(chǎn)生需要經(jīng)過自由基的引發(fā)、增長和終止3個階段。在引發(fā)階段，自由基數(shù)量較少，隨后迅速增加，慢慢的趨于平穩(wěn)后終止，因此抗氧化能力便呈現(xiàn)上述趨勢。

圖6　60 μg/mL核桃多酚、TBHQ、VE溶液在β-胡蘿卜素漂白測試體系下的抗氧化能力Fig.6　Antioxidant activity of 60 μg/ mL walnut polyphenols, TBHQ and VE measured by β-carotene bleaching assay

3　結(jié)論

(1)酸化乙醇超聲輔助處理核桃仁的方法，不僅可以提取活性較高的核桃多酚，提高核桃仁的附加值，而且處理后的核桃仁多酚殘留量更低，顏色更好，可為后續(xù)制備核桃乳提供更好的原材料，同時不產(chǎn)生工業(yè)廢水，有益于環(huán)境保護。

(2)從體外抗氧化評價體系可以看出，核桃多酚能夠在極性較強的體系中表現(xiàn)出高于TBHQ、VC、VE的抗氧化活性，其抗氧化活性與濃度成正相關(guān)。

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Ultrasonic Extraction of Walnut (JuglansregiaL.) Kernel and Analysis of the Oxidation Resistance of the Extracts

LI Xiao-xiao, ZHANG Wen-bin*, YANG Rui-jins

(College of Food,Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122)

[Objective] To extract polyphenols fromJuglansregiaL.with realtivley high activity, and to enhance the utilization value ofJ.regia.[Method] Ultrasonic extraction was applied directly to processJ.regiakernel by adding 70% ethanol containing 0.05 mol/L hydrochloric acid.The total phenol content was measured by Folin-Ciocalteu method.The antioxidant activity was evaluated using free radicals scavenging capacity and iron ion reducing ability.[Result] As for the four times ultrasonic extraction (65 ℃, 10 min) ofJ.regiaextracting solution, polyphenols content was (12.03±0.16)mg/g walnut kernel; The remained polyphenols in the kernel was 0.38 mg/g walnut kernel, which was lower than that in walnut kernel treated with conventional alkali soaking method.Compared with t-butyl hydroqumone (TBHQ) and vitamin C, walnut polyphenol extract showed superior antioxidant capacity in terms of scavenging free radicals and reducing iron ion.[Conclusion] Direct ultrasonic extraction of walnut kernel not only removed polyphenols with high efficiency but also provided potential antioxidant additive for food industry.

Walnut kernels; Polyphenols; Antioxidant activity; Ultrasonic extraction

國家自然科學(xué)基金項目(31401635)；國家“863”計劃研究項目(2013AA102014)。

李笑笑(1989- )，女，河南鞏義人，碩士研究生，研究方向：食品加工與配料。*通訊作者，副教授，從事食品加工與配料研究。

2016-04-18

TS 201.1

A

0517-6611(2016)19-090-04