白美玲,劉星亮,張林西,李海軍

(河北北方學(xué)院 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、2.附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、3.生命科學(xué)研究中心，河北 張家口　075000)

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魚藤素對食管癌EC-109細(xì)胞增殖的抑制作用及部分機(jī)制

白美玲1,劉星亮2,張林西3,李海軍1

(河北北方學(xué)院 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、2.附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、3.生命科學(xué)研究中心，河北 張家口075000)

Inhibitory effect of deguelin on esophageal cancer EC109 cells and its mechanism

BAI Mei-ling1，LIU Xing-liang2, ZHANG Lin-xi3, LI Hai-jun1

(1.BasicMedicalCollege, 2.DeptofNeurologyoftheFirstAffiliatedHospital, 3.LifeSciencesResearchCenter,HebeiNorthUniversity,ZhangjiakouHebei075000,China)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.029

氧化應(yīng)激；魚藤素； Keap1-Nrf2通路; HO-1；食管癌；流式細(xì)胞術(shù)

氧化和抗氧化失衡在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用被越來越多的學(xué)者所關(guān)注[1-2]。本實(shí)驗(yàn)擬通過安全有效的體外實(shí)驗(yàn)來觀察魚藤素在食管癌細(xì)胞中的作用效果，同時觀察慢性氧化應(yīng)激相關(guān)通路在其中的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑魚藤素(deguelin)購自Sigma公司，p-Akt兔抗人單克隆抗體、Nrf2兔抗人單克隆抗體、HO-1鼠抗人單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人食管癌細(xì)胞株EC-109由河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心惠贈。將復(fù)蘇后的EC-109細(xì)胞分為對照組和魚藤素組(濃度為20、40、80、160 nmol·L-1)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞增殖抑制的檢測采用CCK-8法，各組分別設(shè)4個復(fù)孔，每組選取1×106個細(xì)胞作用24、48 h 后，波長為490 nm酶標(biāo)儀測光密度值(OD)。

1.4檢測細(xì)胞周期收集藥物作用24h的各組細(xì)胞1×106個，離心，并按照說明書步驟通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.5瓊脂糖凝膠電泳觀察細(xì)胞凋亡用對照組和不同濃度魚藤素藥物組提取的DNA樣品觀察凋亡情況。

1.6蛋白質(zhì)印跡法檢測p-Akt、Nrf2和HO-1的表達(dá)各組加入蛋白裂解液提取總蛋白，分別加入一抗和二抗，DAB顯色觀察。

2　結(jié)果

各組作用24 h后，各藥物組均可明顯抑制EC-109細(xì)胞的增殖，且兩者有協(xié)同作用。由Tab 1可見，對照組細(xì)胞的生長主要阻滯在S期，而魚藤素組主要阻滯在G0/G1期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度的魚藤素作用24 h后可見凋亡率隨著藥物濃度的升高而增加。Western印跡法分析顯示，p-Akt 、Nrf2和 HO-1蛋白條帶的光密度均低于對照組(P<0.05)。

Tab 1　Cell cycle of different groups in 24 h

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3　討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著魚藤素的濃度增高，能明顯地抑制EC-109癌細(xì)胞的增殖，并在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中也發(fā)揮重要作用，具有濃度-時間效應(yīng)(P<0.05)。已有研究表明[3-4]，通過細(xì)胞生長周期的調(diào)控來減緩細(xì)胞增殖速度、加快細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明魚藤素阻滯了細(xì)胞周期，抑制了EC-109細(xì)胞的增殖過程。

在本實(shí)驗(yàn)中，通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，魚藤素組較對照組的p-Akt蛋白量略減少，Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)量亦下降。推測魚藤素發(fā)揮抗氧化作用是通過抑制磷酸化Akt(p-Akt)的激活，即PI3K/Akt通路的失活，從而降低了p-Akt磷酸化Nrf2，抑制了內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)生成通路的激活，失活后的Nrf2引發(fā)其下游靶基因人血紅素加氧酶1(HO-1)的表達(dá)量下降，整個過程為一個連續(xù)的級聯(lián)反應(yīng)。而在此過程中，PI3K/Akt通路和Keap1-Nrf2通路呈正向調(diào)節(jié)作用，也為魚藤素在臨床上的應(yīng)用推廣奠定了理論基礎(chǔ)。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心完成。)

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oxidative stress; deguelin; Keap1-Nrf2 pathway; HO-1; esophageal cancer; flow cytometry

2016-04-15,

2016-05-15

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究青年基金項(xiàng)目(No QN2014217)；河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(No ZD20140202)；河北北方學(xué)院青年基金項(xiàng)目(No Q2014033)

白美玲(1979-)，女，碩士，講師，研究方向:消化系統(tǒng)腫瘤，通訊作者，E-mail：blxiaobai2013@163.com

A

1001-1978(2016)08-1181-02

R329.24；R349.1；R735.102.2；R979.1

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-7-19 10:43網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.058.html

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