竇夢(mèng)云，何淑芳，黃　成，潘永露，張　野

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 合肥　230601)

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慢病毒介導(dǎo)的NGF基因沉默對(duì)PC12細(xì)胞分化的影響

竇夢(mèng)云，何淑芳，黃成，潘永露，張野

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 合肥230601)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.024

目的探討慢病毒介導(dǎo)的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)基因沉默后對(duì)大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(pheochromocytoma cell，PC12)分化的影響及其機(jī)制。方法構(gòu)建NGF shRNA慢病毒載體。培養(yǎng)PC12細(xì)胞，隨機(jī)分為5組(n=3)：① 正常對(duì)照組(NC)：PC12細(xì)胞置于DMEM/HG細(xì)胞培養(yǎng)液和促感染試劑polybrene中培養(yǎng)；② 空病毒感染組(LV CON)：PC12細(xì)胞置于空病毒和polybrene中培養(yǎng)；③ 慢病毒NGF shRNA1感染組(LV shNGF1)：PC12細(xì)胞置于慢病毒NGF shRNA1和polybrene中培養(yǎng)；④ 慢病毒NGF shRNA2感染組(LV shNGF2)：PC12細(xì)胞置于慢病毒NGF shRNA2和polybrene中培養(yǎng)；⑤ 慢病毒NGF shRNA3感染組(LV shNGF3)：PC12細(xì)胞置于慢病毒NGF shRN3和polybrene中培養(yǎng)。處理結(jié)束后，熒光顯微鏡下檢測(cè)感染效率、熒光定量RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞 NGF mRNA表達(dá)水平、Western blot法檢測(cè)慢病毒感染后細(xì)胞NGF、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)和磷酸化-ERK1/2(phosphorylated ERK1/2，p- ERK1/2)蛋白表達(dá)，細(xì)胞增殖檢驗(yàn)試劑(cell counting kit-8，CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞活性，顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞形態(tài)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞突起長(zhǎng)度和最大細(xì)胞直徑。結(jié)果慢病毒感染PC12細(xì)胞的效率超過(guò)90%。與NC組相比，LV shNGF3組NGF mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，NGF蛋白水平明顯降低(P<0.05)，ERK1/2蛋白表達(dá)和細(xì)胞活性無(wú)差異，p-ERK1/2蛋白表達(dá)有明顯下降(P<0.01)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞突起長(zhǎng)度和最大細(xì)胞直徑均變小(P<0.01)，細(xì)胞分化被抑制。結(jié)論慢病毒介導(dǎo)的NGF基因沉默通過(guò)抑制ERK1/2活化，影響PC12細(xì)胞分化。

慢病毒；NGF；基因沉默；PC12細(xì)胞；分化；ERK1/2

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中重要一員，其在感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(pheochromocytoma cell，PC12)是大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞株，由于其可在NGF誘導(dǎo)下向交感神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，目前廣泛用于神經(jīng)細(xì)胞功能等的研究。研究證實(shí)，NGF與細(xì)胞膜上受體酪氨酸激酶A(tyrosinekinase A，TrkA)結(jié)合，調(diào)節(jié)交感神經(jīng)等的再生和分布[2]。同時(shí)，研究證實(shí)，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)參與了NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞分化。RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是一種由內(nèi)源性或外源性的雙鏈RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于基因治療與研究[3]。短發(fā)卡RNA(short-hairpin RNA，shRNA)作為一種重要的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，在使用慢病毒作為載體介導(dǎo)shRNA轉(zhuǎn)染時(shí)，對(duì)分裂期和非分裂期細(xì)胞均有很高的轉(zhuǎn)染效率[4]。本研究利用慢病毒介導(dǎo)shRNA 沉默NGF基因后，觀察其對(duì)PC12細(xì)胞活力和細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響，并探究ERK1/2在這一過(guò)程中發(fā)揮的作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株P(guān)C12來(lái)源于大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù))。

1.1.2藥物與試劑慢病毒NGF-GFP(滴度：5×108TU·mL-1,分別為NGF shRNA1、NGF shRNA2、NGF shRNA3)、空病毒CON-GFP(滴度：1×109TU·mL-1)及促轉(zhuǎn)染試劑polybrene(5 mg·L-1)，由上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司構(gòu)建合成、提供(合同號(hào)：GIEL65719)。DMEM/HG細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hy-clone公司；胎牛血清、0.25%胰酶消化液(含0.02% EDTA)購(gòu)自加拿大Wisent公司；TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；細(xì)胞增殖檢驗(yàn)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；鼠抗β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司，兔抗NGF多克隆抗體購(gòu)自于英國(guó)Abcam公司，兔抗ERK1/2單克隆抗體和兔抗p-ERK1/2單克隆抗體均來(lái)自于美國(guó)Cell Signaling公司；辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗兔、羊抗鼠抗體購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司；PrimeScriptTMRT reagent kit、SYBR?Premix Ex TaqTM均購(gòu)自于日本TaKaRa公司；內(nèi)參β-actin引物購(gòu)自于上海生工公司，NGF引物購(gòu)自廣州復(fù)能基因公司。

1.1.3儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；CXY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)；Tanon Fine Do X6全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有公司)；熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞株置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱(95%空氣)中，含10%胎牛血清的DMEM /HG完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化約1 min，計(jì)數(shù)，以1 ∶3的比例傳代，每2～3 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及慢病毒感染PC12細(xì)胞以每孔105個(gè)接種于6孔培養(yǎng)板。細(xì)胞隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組(NC)、空病毒感染組(LV CON)、慢病毒NGF shRNA1感染組(LV shNGF1)、慢病毒NGF shRNA2感染組(LV shNGF2)、慢病毒NGF shRNA3感染組(LV shNGF3)。種板12 h后，除NC組以含10%胎牛血清的DMEM/HG培養(yǎng)基、polybrene(終濃度為2.5 mg·L-1)處理外，其余各組均以含10%胎牛血清的DMEM/HG培養(yǎng)基、polybrene(終濃度為2.5 mg·L-1)及相應(yīng)感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為20的慢病毒進(jìn)行感染，24 h后換用含10%胎牛血清的DMEM/HG完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。每組3個(gè)復(fù)孔。

1.2.3熒光顯微鏡檢測(cè)感染效率按照上述方法進(jìn)行分組和慢病毒感染細(xì)胞72 h后，熒光顯微鏡下觀察表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)的細(xì)胞數(shù)目，根據(jù)GFP表達(dá)情況判斷感染效率。感染效率(熒光率)大于90%，說(shuō)明已篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。

1.2.4熒光定量RT-PCR檢測(cè)NGF mRNA表達(dá)水平慢病毒感染96 h后，棄培養(yǎng)液，4 ℃預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞，按照RNA提取試劑TRIzol的說(shuō)明書進(jìn)行操作，每孔加800 μL TRIzol置于冰上裂解10 min，提取細(xì)胞總RNA。經(jīng)氯仿萃取，異丙醇法沉淀，75%無(wú)酶乙醇洗滌法濃縮，DEPC水溶解后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度，制成RNA樣品。按照PrimeScriptTMRT reagent kit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用于檢測(cè)NGF和內(nèi)參β-actin mRNA (NGF引物序列保密)。β-actin引物：上游引物5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游引物5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。采用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR擴(kuò)增程序設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 3 s, 60 ℃ 30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)結(jié)束后建立熔解曲線。采用StepOne Software v 2.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。同一實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用2-△△CT法計(jì)算。

1.2.5Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平細(xì)胞感染72 h后，1 ∶3傳代，接種于6孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)液。4 ℃預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞，培養(yǎng)板內(nèi)加入蛋白裂解液充分裂解細(xì)胞，冰上靜置30 min后，15 000 r·min-14 ℃離心10 min后，吸取上清，BCA法測(cè)定樣品蛋白含量后分裝保存。每組取20 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將PVDF膜在封閉液(含5%脫脂牛奶的TBST溶液)中室溫孵育2 h，隨后置于兔抗NGF多克隆抗體、兔抗ERK1/2單克隆抗體、兔抗p-ERK1/2單克隆抗體或鼠抗β-actin單克隆抗體中，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次5 min；再將膜置入HRP標(biāo)記的二抗中室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；采用ECL發(fā)光試劑盒，在Tanon全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)中自動(dòng)曝光采集圖像，并進(jìn)行條帶光密度分析。

1.2.6CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞，以每孔104個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。按上述方法進(jìn)行分組及慢病毒感染，分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72 h檢測(cè)吸光度。每孔加入10 μL CCK-8溶液(加入的體積為原來(lái)培養(yǎng)體積的10% )，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后，置于酶標(biāo)儀上450 nm測(cè)定各組吸光度。在不含細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入等量CCK-8溶液，按相同方法測(cè)定吸光度作為空白對(duì)照孔。細(xì)胞活力=測(cè)定孔的吸光度-空白對(duì)照孔吸光度，并計(jì)算平均值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.7細(xì)胞分化程度測(cè)定慢病毒感染72 h后，顯微鏡下觀察NC組、LV CON組和LV shNGF3組細(xì)胞形態(tài)并攝片。采用Image J2圖像分析軟件測(cè)量每組細(xì)胞突起長(zhǎng)度和最大細(xì)胞直徑。同一細(xì)胞至少重復(fù)統(tǒng)計(jì)3次。

2.1熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞感染效率細(xì)胞感染72 h后，熒光顯微鏡下觀察可見大量綠色熒光顆粒，細(xì)胞表達(dá)GFP蛋白，見Fig 1A。與同一視野下明場(chǎng)相比，表達(dá)GFP細(xì)胞超過(guò)90%，見Fig 1 B，說(shuō)明已建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。

Fig 1　Lentivirus transfection efficiency in PC12 cells

A:GFP expression of lentivirus infected PC12 cells under fluorescent microscope;B:Cells under bright field of optical microscope

2.2慢病毒LV shNGF3可有效抑制NGF mRNA表達(dá)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，LV shNGF3組NGF mRNA表達(dá)明顯降低，是NC組的(13±4)%(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見Fig 2。

Fig 2　LV shNGF3 restrained NGF

*P<0.05vsNC group

2.3慢病毒LV shNGF3可有效抑制NGF蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，LV shNGF3 NGF蛋白表達(dá)水平明顯降低，是NC組的(38±19)%(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見Fig 3。說(shuō)明慢病毒LV shNGF3可有效抑制NGF蛋白的表達(dá)。

2.4NGF表達(dá)抑制未明顯影響PC12細(xì)胞活性與NC組相比，LV shNGF3組細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見Fig 4。說(shuō)明慢病毒感染介導(dǎo)NGF基因沉默未影響PC12細(xì)胞活性。

Fig 3　LV shNGF3 decreased NGF protein

*P<0.05vsNC group

Fig 4　Lentivirus mediated NGF shRNA transfection

2.5NGF表達(dá)降低抑制PC12細(xì)胞分化NGF表達(dá)抑制后，PC12細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，見Fig 5A。NC組和LV CON組PC12細(xì)胞胞體呈圓形、長(zhǎng)梭形，兩極有長(zhǎng)突起，細(xì)胞折光性較強(qiáng)，細(xì)胞間形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。LV shNGF3組NGF表達(dá)抑制后，PC12細(xì)胞胞體呈三角形、多角形，細(xì)胞除兩極有軸突樣突起外，有的細(xì)胞質(zhì)伸出其他突起，突起長(zhǎng)度明顯縮短，細(xì)胞折光性降低。與NC組相比，LV CON組細(xì)胞突起長(zhǎng)度和最大細(xì)胞直徑無(wú)差異，而LV shNGF3組細(xì)胞突起長(zhǎng)度和最大細(xì)胞直徑均明顯縮短(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見Fig 5B。說(shuō)明慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)PC12細(xì)胞分化未產(chǎn)生明顯影響，而NGF表達(dá)降低明顯抑制了PC12細(xì)胞的分化。

Fig 5　LV shNGF3 inhibited differentiation of PC12 ±s,n=3)

A：The morphology of PC12 cells;B:The length of neuritis and max diameter of cells were strained in LV shNGF3 group than that in NC group.**P<0.01vsNC group

2.6NGF表達(dá)抑制對(duì)PC12細(xì)胞ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響ERK蛋白以及p-ERK1/2是絲裂素活化蛋白激酶(mitogen-activted protein kinase, MAPK)信號(hào)通路的重要蛋白。Western blot結(jié)果顯示，NC組、LV CON組和LV shNGF3組ERK1/2蛋白表達(dá)無(wú)差異。而與NC相比，LV shNGF3組p-ERK1/2蛋白表達(dá)下降了85.2%(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見Fig 6。說(shuō)明NGF表達(dá)抑制后，通過(guò)抑制p-ERK1/2表達(dá)影響PC12細(xì)胞分化。

3　討論

慢病毒是一種以人類免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)為基礎(chǔ)構(gòu)建的新型載體系統(tǒng)，因其對(duì)分裂期和非分裂期細(xì)胞均有很高的轉(zhuǎn)染效率，廣泛應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染和基因治療等[5]。shRNA在利用慢病毒為載體時(shí)，shRNA可整合到細(xì)胞基因組中。shRNA在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)一系列酶的作用后，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)，以序列特異性的方式結(jié)合到靶mRNA，從而抑制靶基因的表達(dá)[6]。故shRNA在體內(nèi)抑制靶基因的表達(dá)具有很高的特異性[7]。polybrene是一種陽(yáng)離子聚合物，可以促進(jìn)慢病毒包膜與細(xì)胞膜的相互作用，協(xié)助慢病毒對(duì)細(xì)胞膜的感染過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)參照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在polybrene協(xié)助下以MOI=20進(jìn)行感染。結(jié)果證實(shí)，此感染復(fù)數(shù)下可以建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，并且NGF LV shRNA3可以有效抑制NGF mRNA和蛋白的表達(dá)(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，LV shNGF2組NGF蛋白相比于NC組降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但LV shNGF2組NGF mRNA表達(dá)卻明顯升高?？赡苡捎贜GF LV shRNA2未能與其特異靶序列相結(jié)合，并通過(guò)影響內(nèi)源性微小RNA(micro RNA，miRNA)，產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，從而影響細(xì)胞NGF mRNA和蛋白的表達(dá)[8]。

Fig 6　Lentivirus mediated NGF gene silencing decreased

A: Western blot analysis of ERK1/2, p-ERK1/2 and β-actin protein;B: The relative protein expression of ERK1/2 and p-ERK1/2 bands were normalized to β-actin.**P<0.01vsNC group

NGF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中重要一員，通過(guò)作用于高親和力受體TrkA和低親和力受體(p75 neurotrophin receptor，P75NTR)調(diào)控中樞及周圍神經(jīng)的生長(zhǎng)、發(fā)育和再生等[2]。最近研究表明，NGF除了具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用以外，還可增加初級(jí)傳入神經(jīng)元對(duì)傷害性刺激的敏感性，在神經(jīng)元傷害感受信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9]。NGF通過(guò)與TrkA結(jié)合，導(dǎo)致自身酪氨酸殘基磷酸化，逆轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)，產(chǎn)生多種信號(hào)分子，并將信號(hào)傳遞至細(xì)胞核，調(diào)控細(xì)胞的基因表達(dá)、代謝等，從而影響細(xì)胞分化[10]。近年來(lái)研究證實(shí)，NGF可以促進(jìn)PC12細(xì)胞向神經(jīng)元分化，并呈濃度相關(guān)性[11]。細(xì)胞最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度和最大細(xì)胞直徑可以作為評(píng)價(jià)PC12細(xì)胞分化程度的指標(biāo)。本研究通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的NGF表達(dá)沉默后，PC12細(xì)胞突起長(zhǎng)度和最大細(xì)胞直徑突起長(zhǎng)度均明顯縮短，細(xì)胞分化程度降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。證實(shí)NGF表達(dá)降低抑制了PC12細(xì)胞向神經(jīng)元分化。

MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、再生等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[12]。ERK1/2是MAPK信號(hào)通路中重要的蛋白，磷酸化后的ERK1/2通過(guò)Ras-Raf-MEK-ERK級(jí)聯(lián)通路將信號(hào)從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞核，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化等多種生理功能[13]。近來(lái)研究表明[14]，ERK1/2蛋白在NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞分化早期活化增加。推測(cè)ERK1/2早期活化可能為NGF誘導(dǎo)的PC12分化提供了起始信號(hào)。其后，活化的ERK1/2被降解，避免了長(zhǎng)時(shí)間過(guò)度刺激對(duì)細(xì)胞的不良影響。本研究通過(guò)慢病毒介導(dǎo)NGF shRNA轉(zhuǎn)染入PC12細(xì)胞，特異性并長(zhǎng)期穩(wěn)定地抑制PC12細(xì)胞NGF表達(dá)，從而導(dǎo)致了ERK1/2蛋白活化被長(zhǎng)期抑制。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，慢病毒介導(dǎo)的NGF基因沉默通過(guò)抑制ERK1/2活化，影響PC12細(xì)胞分化，為進(jìn)一步研究體內(nèi)NGF基因沉默對(duì)神經(jīng)元功能和傷害感受信號(hào)傳導(dǎo)的影響，提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

(致謝：感謝安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室為本課題研究提供儀器設(shè)備和技術(shù)支持。)

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Lentivirus-mediated NGF gene silencing inhibited differentiation of PC12 Cells

DOU Meng-yun, HE Shu-fang, HUANG Cheng, PAN Yong-lu, ZHANG Ye

(DeptofAnesthesiology,theSecondAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity，Hefei230601,China)

AimTo investigate the effects of lentivirus mediated nerve growth factor(NGF) gene silencing on pheochromocytoma cells(PC12) and the possible mechanisms.MethodsThe NGF shRNA expression vector was constructed. PC12 cells were randomly divi-ded into five groups(n=3 each) as follows:negative control group(NC), control lentivirus group(LV CON), lentivirus NGF shRNA1 group(LV shNGF1), lentivirus NGF shRNA2 group(LV shNGF2), lentivirus NGF shRNA3 group(LV shNGF3). The cells in NC group were cultured in DMEM/HG and polybrene medium, while others were cultured in DMEM/HG, polybrene and corresponding lentivirus medium. After the treatment, the infection efficiency was determined by fluorescent microscope. Relative expression of NGF, extracellular signal-regulated kinase(ERK1/2) and p-ERK1/2 were assessed by Western blot. The expression of NGF mRNA was analyzed by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR). The differentiation degree was valued according to the length of neuritis and max diameter of cells. The cell viability was detected by CCK-8.ResultsThe infection efficiency in PC12 cells reached over 90%. Compared with NC group, the relative expression of NGF mRNA and NGF protein was significantly down-regulated(P<0.05).There was no difference in the expression of ERK1/2 protein and cell viability. The expression of p-ERK1/2 protein was markedly down-regulated in LV shNGF3 group(P<0.01).The cells morphology was changed, and the length of neuritis and max diameter of cells were strained in LV shNGF3 group than those in NC group(P<0.01).ConclusionLentivirus-mediated NGF gene silencing inhibits the differentiation of PC12 cells through suppressing the activation of ERK1/2.

lentivirus; NGF; gene silencing; pheochromocytoma cell; differentiation;extracellular signal-regulated kinase

2016-04-17，

2016-05-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81471145)

竇夢(mèng)云(1993-)，女，碩士生，研究方向：麻醉藥理學(xué)，E-mail: 1570122622@qq.com；

張野(1968-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：麻醉藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: zhangye_hassan@sina.com

A

1001-1978(2016)08-1153-06

R373.9；R329.24；R394.2；R977.6

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-7-19 10:43網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.048.html