潘智育,李　竟,陳云龍，王春苗,彭　政,粟正英,黎丹戎,侯華新

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧　530021；2. 黑龍江省齊齊哈爾市第一醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾　161005；3. 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣西 南寧　530021)

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8-溴乙氧基大黃酸的合成及其對肝癌HepG2.2.15細(xì)胞乙肝病毒抑制作用的研究

潘智育1,李竟1,陳云龍2，王春苗1,彭政1,粟正英1,黎丹戎3,侯華新1

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧530021；2. 黑龍江省齊齊哈爾市第一醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾161005；3. 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣西 南寧530021)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.028

目的合成8-溴乙氧基大黃酸，探討8-溴乙氧基大黃酸對肝癌HepG2.2.15細(xì)胞分泌的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的抑制作用和機(jī)制。方法以大黃酸為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，化學(xué)全合成8-溴乙氧基大黃酸，采用紅外光譜(IR)、核磁共振氫譜(1H-NMR)及碳譜(13C-NMR)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征；MTT法測定8-溴乙氧基大黃酸對細(xì)胞生長的抑制作用；ELISA檢測HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg和HBeAg；Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒X基因(HBx)蛋白的表達(dá)；流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期；激光共聚焦顯微鏡測定細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。結(jié)果IR、1H-NMR和13C-NMR的結(jié)果確證合成產(chǎn)物為8-溴乙氧基大黃酸，合成產(chǎn)物和大黃酸對HepG2.2.15細(xì)胞具有較好的抑制細(xì)胞生長的作用，作用72 h后IC50分別為14.29 mg·L-1和11.59 mg·L-1。采用無細(xì)胞毒劑量的8-溴乙氧基大黃酸處理細(xì)胞后，對細(xì)胞分泌的HBsAg和HBeAg有抑制作用，其抑制作用隨著濃度的增加，呈現(xiàn)劑量依賴性，且合成產(chǎn)物的抑制效果優(yōu)于大黃酸；8-溴乙氧基大黃酸可降低HBx蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，阻礙乙型肝炎病毒(HBV)復(fù)制，但不影響細(xì)胞周期。結(jié)論本研究合成的8-溴乙氧基大黃酸顯示了比大黃酸更為優(yōu)越的抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg的分泌作用的活性，其作用機(jī)制可能是通過降低HBx蛋白表達(dá)、減少鈣離子濃度而實(shí)現(xiàn)。

8-溴乙氧基大黃酸；大黃酸；肝癌；乙型肝炎病毒；HBx；細(xì)胞內(nèi)鈣離子

原發(fā)性肝癌是一種發(fā)病率高、發(fā)現(xiàn)晚、惡化程度高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類的生命和健康。近年的流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國肝癌死亡率在各種惡性腫瘤中居于第三位[1]，而廣西肝癌死亡率居惡性腫瘤之首位，且乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的重要病因[2]。因此，積極探究肝癌的發(fā)病機(jī)制、尋找有效抑制乙肝病毒感染的抗肝癌藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

蒽醌類化合物廣泛存在于天然植物中，如大黃、何首烏、黃根等，隨著對蒽醌類物質(zhì)研究的深入，發(fā)現(xiàn)其具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等重要的藥理作用。如今臨床上廣泛應(yīng)用的阿霉素、米托蒽醌等化療藥物就屬于蒽醌類化合物。大黃酸是一種研究較多的蒽醌化合物，可通過阻滯細(xì)胞周期、增強(qiáng)半胱天冬氨酸蛋白酶活性等機(jī)制誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[3-4]。但其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是否通過抑制乙肝病毒的復(fù)制、分泌作用尚不清楚，且大黃酸水溶性較差，與臨床抗腫瘤藥物相比存在特異性不高、功效低等問題，影響其生物活性的發(fā)揮。

為了進(jìn)一步開發(fā)大黃酸及蒽醌化合物的藥用價值，減少乙型肝炎病毒誘發(fā)肝癌的可能，改善肝癌高發(fā)生率、高死亡率的現(xiàn)狀，尋找更理想的抗肝癌藥物，本文以大黃酸為原料合成了溶解度好、毒性小、抗腫瘤活性強(qiáng)且抑制病毒能力高的8-溴乙氧基大黃酸，并探討該合成產(chǎn)物對人肝癌HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg的影響及其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物與試劑大黃酸購自南京郎澤生物醫(yī)藥有限公司，含量大于98%；拉米夫定(3TC)為葛蘭素史克制藥(蘇州)有限公司生產(chǎn)；二甲基亞砜、丙酮、1，2-二溴乙烷、乙酸乙酯、石油醚(分析純，汕頭西隴化工)；噻唑藍(lán)(MTT，北京Solarbio公司)；MEM培養(yǎng)基(Hyclone)；小牛血清(Gibco)；胰酶(美國 Amersco 公司)； Fluo-3/AM(美國Biotium公司)；HBsAg和HBeAg ELISA 檢測試劑盒(上?？迫A生物工程有限公司)；周期檢測試劑盒(Bender Med system)；鼠抗HBx(Santa Cruz)；兔抗GAPDH(Abcam)；羊抗鼠lgG-HRP(Santa Cruz)；Goat pAb to Rb lgG-HRP(Abcam)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物(Boster Biological Technology)。

1.1.2儀器Set-laborata4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國 Heidolph 公司)；Axiovert 200熒光倒置相差顯微鏡(德國 Zeiss 公司)；化學(xué)發(fā)光成像工作站(FlourChem M)；Calibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；激光共聚焦顯微鏡 NikonA1(日本尼康出品)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Multiskan MK3酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；1H-NMR 和13C-NMR采用500兆核磁共振儀(美國 Vrain 公司)測定；紅外光譜由100FTIR光譜儀(美國 Perkin Elmer 公司)測定。

1.1.3細(xì)胞人肝癌HepG2.2.15細(xì)胞購自武漢大學(xué)保藏中心細(xì)胞庫。細(xì)胞在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)以含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)液在培養(yǎng)瓶內(nèi)單層傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2方法

1.2.18-溴乙氧基大黃酸的合成在100 mL三口瓶中依次加入500.0 mg大黃酸(1.76 mmol)，486.0 mg碳酸鉀(3.52 mmol)，35 mL DMF，混勻加熱到60℃， 恒溫攪拌30 min，緩慢滴加5.291 g(28.16 mmol)1,2-二溴乙烷，TLC點(diǎn)板檢測跟蹤反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)1.5 h后TLC點(diǎn)板，反應(yīng)原料點(diǎn)消失。過濾除去碳酸鉀。加入丙酮，使DMF與丙酮形成共沸物，80℃減壓旋蒸除去大部分DMF，將濃縮的反應(yīng)液倒入冰水中靜止，析出沉淀，過濾，用冰水洗滌多次，將殘留的DMF除去，得到粗品。采用硅膠柱層析，以石油醚 ∶乙酸乙酯(80 ∶1)為洗脫劑洗脫，除去溶劑，得到橙黃色固體，合成產(chǎn)物進(jìn)行理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2.2合成產(chǎn)物配制合成產(chǎn)物用DMSO溶解后配成10 g·L-1原液，0.2 μm有機(jī)系濾膜過濾除菌，避光保存。藥物使用時，采用無血清培養(yǎng)基配制成所需的濃度，并使DMSO 終濃度小于2%。

1.2.3MTT法測定8-溴乙氧基大黃酸對細(xì)胞生長的抑制作用取對數(shù)生長期的HepG2.2.15細(xì)胞，以6.8×107·L-1密度接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后，分別加入100 μL濃度為40、20、10、5、2.5、0 mg·L-1的8-溴乙氧基大黃酸和大黃酸，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。連續(xù)培養(yǎng)72 h，每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL使結(jié)晶完全溶解。采用酶標(biāo)儀在492 nm處檢測吸光度值(OD值)。按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長的抑制率和半數(shù)抑制濃度IC50值。生長抑制百率/%=[1-(藥物組OD值/對照組OD值)]×100%，選擇對細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)幾乎無影響的相應(yīng)劑量作為后續(xù)研究的濃度。

1.2.4ELISA法定量檢測細(xì)胞HBsAg和HBeAg分泌情況將2.5×107·L-1的細(xì)胞懸液加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 mL，置 CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后除去全部培養(yǎng)液。分別加入對細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)幾乎無影響的IC15、IC10、IC53個終濃度的不同藥物溶液，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔?？瞻讓φ战M加入等量的完全培養(yǎng)液，參照文獻(xiàn)選擇100 mg·L-1拉米夫定為陽性對照[5]。連續(xù)培養(yǎng)72 h后，分別吸出細(xì)胞上清液置于1.5 mL滅菌離心管中，-20℃保存，統(tǒng)一待檢。采用ELISA試劑盒對上清HBsAg、HBeAg進(jìn)行檢測，操作按試劑盒的使用說明書進(jìn)行，結(jié)果以抑制率表示。藥物對抗原的抑制百分率(IR)/%=[1-(藥物組OD值/對照組OD 值)]×100%。

1.2.5流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期將HepG2.2.15細(xì)胞接種于6孔板中24 h后，加入藥物濃度均為IC10的8-溴乙氧基大黃酸和大黃酸，以等量的完全培養(yǎng)液為空白對照，以拉米夫定為陽性對照藥。處理72 h后，胰酶消化后用PBS漂洗，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×108·L-1。75%乙醇固定過夜， 加入RNase A、300 μL碘化丙啶(PI)，4℃避光下作用30 min。用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期的分布。

1.2.6Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)HBx蛋白8-溴乙氧基大黃酸和大黃酸均以IC10的藥物濃度處理HepG2.2.15細(xì)胞，以等量的完全培養(yǎng)液為空白對照,含100 mg·L-1拉米夫定的等量完全培養(yǎng)液為陽性對照。細(xì)胞經(jīng)藥物處理72 h后，提取蛋白,用 BCA 法檢測蛋白含量后,以相同的蛋白量上樣,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉,鼠抗HBx(按1 ∶100稀釋)一抗稀釋液4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，再用HRP標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG(按1 ∶1 000稀釋)二抗稀釋液常溫孵育2 h，PBST 洗滌3次，超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物反應(yīng)后，用化學(xué)發(fā)光成像儀掃描結(jié)果。

1.2.7激光共聚焦檢測細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108·L-1，接種于激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿中，每皿2 mL細(xì)胞懸液。培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液，加入藥物濃度為IC10的8-溴乙氧基大黃酸和大黃酸，以等量的完全培養(yǎng)液為空白對照，以拉米夫定為陽性對照藥。處理72 h后用 HEPES緩沖液洗3遍，每皿加入8 μmol·L-1的 Fluo-3/AM熒光染料，37℃避光負(fù)載50 min，HEPES緩沖液洗3遍，于激光掃描共聚焦顯微鏡下，選擇激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm，激光強(qiáng)度9.0，光電倍增管電壓110 v條件下攝圖。記錄并分析熒光強(qiáng)度。

2　結(jié)果

2.18-溴乙氧基大黃酸的結(jié)構(gòu)鑒定合成產(chǎn)物為橙黃色粉末，mp：156℃～158℃，純度為98.0%。IR、1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)見Tab 1。

2.28-溴乙氧基大黃酸對細(xì)胞生長的抑制作用從Tab 2可知,隨著8-溴乙氧基大黃酸和大黃酸濃度的增高,HepG2.2.15細(xì)胞抑制率相應(yīng)增高，呈濃度依賴性。8-溴乙氧基大黃酸和大黃酸對HepG2.2.15作用72 h的IC50分別為14.29 mg·L-1和11.59 mg·L-1。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，當(dāng)8-溴乙氧基大黃酸和大黃酸的抑制率小于15%時，HepG2.2.15細(xì)胞無論在形態(tài)上還是數(shù)量上與空白對照相同。因此,選擇8-溴乙氧基大黃酸IC15(6.76 mg·L-1)、IC10(5.02 mg·L-1)、IC5(3.16 mg·L-1)和大黃酸IC15(6.03 mg·L-1)、IC10(4.89 mg·L-1)、IC5(2.88 mg·L-1)作為后續(xù)研究濃度。

2.38-溴乙氧基大黃酸對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg的影響經(jīng)無細(xì)胞毒濃度IC15、IC10、IC5作用72 h后，8-溴乙氧基大黃酸和大黃酸對HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg和HBeAg 有明顯的抑制作用，除了IC5濃度外，其他各組濃度對病毒抑制作用與陽性藥物拉米夫定相似。且抑制作用隨著濃度的增加，幾乎呈現(xiàn)劑量依賴性。同時在相同抑制率濃度下，8-溴乙氧基大黃酸對病毒HBsAg的抑制效果優(yōu)于大黃酸(Tab 3)。

2.4流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期與空白對照組相比，經(jīng)藥物濃度為IC10的8-溴乙氧基大黃酸和大黃酸作用72 h后，細(xì)胞G1、G2和S期分布差異均無顯著性(P>0.05) ；而陽性對照組拉米夫定與空白對照組相比，G1、G2和S期差異均存在顯著性(P<0.01)。見Fig 1。

2.5Western blot法檢測8-溴乙氧基大黃酸對細(xì)胞內(nèi)HBx蛋白表達(dá)的影響如Fig 2所示，人肝癌細(xì)胞HepG2.2.15細(xì)胞中HBx蛋白表達(dá)較高，與空白對照組比較，拉米夫定和8-溴乙氧基大黃酸均能夠明顯降低HBx蛋白的表達(dá)(P<0.05)，而未經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾的大黃酸并不能降低HBx蛋白的表達(dá)。提示大黃酸經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾后的8-溴乙氧基大黃酸具有更強(qiáng)的抑制肝癌病毒作用。

2.6激光共聚焦檢測細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度細(xì)胞內(nèi)鈣離子與Fluo-3/Am熒光染料結(jié)合后顯綠色熒光, 其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度成正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，HBx可激活鈣離子刺激的轉(zhuǎn)錄因子，其在宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)HBV DNA復(fù)制與釋放線粒體內(nèi)鈣引起的胞質(zhì)鈣離子濃度升高密切相關(guān)。

從Tab 4結(jié)果可見，在正常情況下，HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)有鈣離子存在，經(jīng)藥物濃度為IC10的8-溴乙氧基大黃酸和大黃酸處理24 h后，大黃酸對鈣離子濃度影響不大；而8-溴乙氧基大黃酸使鈣離子濃度下降，與空白組比較，差異存在顯著性(P<0.05)。結(jié)果證明，8-溴乙氧基大黃酸與陽性對照拉米夫定作用相似，可降低HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。

3　討論

乙型肝炎病毒感染是我國肝癌發(fā)生的最主要原因，抗HBV在治療肝癌中具有舉足輕重的作用。目前，公認(rèn)的抗HBV治療藥物主要有α干擾素和核苷類似物[6]。大多數(shù)核苷類藥物可抑制HBV DNA聚合酶活性進(jìn)而抑制病毒,從而達(dá)到抗HBV療效；而α干擾素通過抑制HBV的復(fù)制和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制,調(diào)節(jié)機(jī)體對HBV的免疫應(yīng)答,二者協(xié)同抗病毒[7-8]。但干擾素不良反應(yīng)較大，核苷類似物存在病毒耐藥問題，大多數(shù)患者在長期治療后仍不能徹底清除病毒。因此，開發(fā)篩選新型低毒的抑制乙肝病毒復(fù)制抗肝癌藥物，并探明其作用機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

Tab 1　IR，1H-NMR and 13C-NMR spectrum of synthetic

Tab 2The inhibitory effect of 8-bromo-ethoxy

Drugconcentration/mg·L-1Inhibitoryrate/%8-bromo-ethoxyRheinRhein 4098.83±0.2595.81±1.61 2054.47±2.1580.87±2.09 1026.30±2.2231.55±2.90 58.67±1.7712.19±2.91 2.52.15±1.412.24±0.68IC50/mg·L-114.29±0.6711.59±1.34

Fig 1　Effect of 8-bromo-ethoxy Rhein on cell cycles in HepG2.2.15 cells

**P<0.01vscontrol

Fig 2　Effect of 8-bromo-ethoxy Rhein

*P<0.05，**P<0.01vscontrol

大黃酸等蒽醌類化合物具有抗病毒、保肝抗纖維化、抗肝癌等藥理活性，且藥理作用已被醫(yī)學(xué)界廣泛認(rèn)可。蒽醌類化合物呈平面型的多芳香環(huán)結(jié)構(gòu)[9], 這種結(jié)構(gòu)可以嵌入到DNA 相鄰的堿基對之間, 以嵌入的形式與 DNA雙螺旋形成可逆的結(jié)合, 使DNA降解,并抑制 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II, 使DNA與拓?fù)洚悩?gòu)酶II形成的復(fù)合物僵化,影響DNA的轉(zhuǎn)錄、合成，從而達(dá)到抗腫瘤的作用[10-13]。但是蒽醌環(huán)結(jié)構(gòu)對DNA的嵌入作用是可逆的，通過側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的修飾可以提高蒽醌類藥物對DNA的嵌入作用, 提高蒽醌類藥物與肝癌細(xì)胞的親合力。為了增加蒽醌環(huán)對肝癌細(xì)胞的親合力，得到溶解性好、毒性小、抗腫瘤活性強(qiáng)且抑制病毒能力高的抗肝癌藥物，本研究在大黃酸的基礎(chǔ)上對側(cè)鏈進(jìn)行修飾，合成了8-溴乙氧基大黃酸。結(jié)果表明，8-溴乙氧基大黃酸和大黃酸均可抑制人肝癌細(xì)胞HepG2.2.15的HBsAg 、HBeAg病毒的分泌，且8-溴乙氧基大黃酸的抑制病毒作用優(yōu)于大黃酸。推測改變大黃酸的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)可以抑制蒽醌環(huán)結(jié)構(gòu)對DNA的嵌入作用的可逆性，促進(jìn)病毒DNA的降解。

HBV基因組含有 S 、C 、P 、X 4個開放讀碼框，其中X基因編碼HBx蛋白。HBx具有廣泛的反式激活功能，激活同源或異源基因的啟動子，促進(jìn)病毒復(fù)制和正常肝細(xì)胞感染，對肝癌的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，將HBx導(dǎo)入小鼠的肝細(xì)胞中，可引起肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。將HBx基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，可誘發(fā)轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌形成，缺失X基因的乙型肝炎病毒不能有效地進(jìn)行感染[14,15]。HBx表達(dá)越高，其感染能力就越強(qiáng)，通過抑制或減少HBx表達(dá)則可降低HBV感染能力，有利于肝癌的治療。此外，HBx涉及鈣信號途徑的介導(dǎo)，能夠上調(diào)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度來保持HBV復(fù)制能力[16]。如Bouchard等[17]指出，HBx蛋白對病毒復(fù)制的影響與細(xì)胞內(nèi)鈣信號傳導(dǎo)通路有關(guān)，通過影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，激活Pyk2，進(jìn)而通過Src影響HBV病毒的復(fù)制。故推測，減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度可間接減少HBx的促HBV激活能力，同時可減少肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)會。

DruganddoseHBsAginhibitoryrate/%IC15IC10IC5HBeAginhibitoryrate/%IC15IC10IC58-bromo-ethoxyRhein43.70±1.29*44.09±0.69*30.71±1.28**29.45±2.8224.96±2.3621.93±1.16*Rhein32.68±3.4825.59±1.5812.20±0.9130.03±2.1234.74±4.8813.17±1.553TC/100mg·L-127.17±3.0114.86±0.79

*P<0.05,**P<0.01 under the concentration at the same inhibitory rate, 8-bromo-ethoxy Rhein was compared with Rhein

Tab 4　Results of intracellular free calcium concentration in each ±s，n=3)

*P<0.05，**P<0.01vscontrol

HepG2.2.15細(xì)胞系是肝癌細(xì)胞HepG2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染4個全長HBV基因組而建立的,能夠穩(wěn)定分泌HBsAg、HBeAg及Dane顆粒,可檢測到細(xì)胞內(nèi)各種中間復(fù)制體,為研究HBV復(fù)制和調(diào)控的分子機(jī)制提供了一個有效的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚18-19]。本研究利用HepG2.2.15細(xì)胞模型證實(shí),8-溴乙氧基大黃酸可明顯降低線粒體鈣離子通道中鈣離子濃度(P<0.01)，與Western blot法結(jié)果中HBx蛋白的表達(dá)降低(P<0.05)相輔相成, 共同說明8-溴乙氧基大黃酸可調(diào)節(jié)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV DNA,降低HBx蛋白的表達(dá),從而減弱HBV病毒的感染能力,最終提高抑制HBV病毒的抗腫瘤作用。此外，研究中還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)無細(xì)胞毒劑量8-溴乙氧基大黃酸、大黃酸作用HepG2.2.15細(xì)胞后，細(xì)胞周期各時相的分布與空白對照組比較無差異，其抑制HepG2.2.15細(xì)胞分泌病毒的作用機(jī)制與拉米夫定存在部分差異，8-溴乙氧基大黃酸有效發(fā)揮作用的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述, 8-溴乙氧基大黃酸具有調(diào)控細(xì)胞HBx蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞線粒體膜內(nèi)鈣離子濃度變化,抑制細(xì)胞HBV病毒的復(fù)制、肝癌細(xì)胞的生長和分泌乙肝病毒的能力等活性，說明對具有蒽醌母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，有可能獲得有應(yīng)用前景的新型低毒抗肝癌藥物，為肝癌的臨床輔助治療研究提供了重要依據(jù)。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心完成，特此致謝。)

[1]陳萬青, 張思維, 曾紅梅, 等. 中國2010年惡性腫瘤發(fā)病與死亡[J]. 中國腫瘤, 2014, 23(1): 1-10.

[1]Chen W Q, Zhang S W, Zeng H M, et al. Report of cancer incidence and mortality in China，2010[J].ChinaCancer, 2014,23(1): 1-10.

[2]赫曉林, 黃建煒, 許瑞安, 崔秀靈. HBV病毒復(fù)制機(jī)制及慢性乙型肝炎藥物靶點(diǎn)[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2015, 31(3): 152-6.

[2]He X L, Huang J W, Xu R A,Cui X L. Hepatitis B virus replication mechanisms and drug targets of chronic hepatitis B[J].ChinPharmacolBull, 2015, 31(3): 152-6..

[3]Lai W W, Yang J S, Lai K C,et al. Rhein induced apoptosis through the endoplasmic reticulum stress, caspase-and mitochondria-dependent pathways in SCC-4 human tongue squamous cancer cells[J].InVivo, 2009, 23(2): 309-16.

[4]Shi P, Huang Z, Chen G. Rhein induces apoptosis and cell cycle arrest in human hepatocellular carcinoma BEL-7402 cells[J].AmJChinMed, 2008, 36(4): 805-13.

[5]李麗, 李勇文, 唐愛存. 甲基阿魏酸對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg的抑制作用[J]. 中藥藥理與臨床, 2011,27(3):14-6.

[5]Li L, Li Y W,Tang A C. The inhibitory effect of methferulic acid on HBsAg and HBeAg in the HepG2.2.15 cells[J].PharmacolClinMed, 2011,27(3):14-6.

[6]衛(wèi)生部. 原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)[J]. 臨床腫瘤學(xué)雜志, 2011, 16(10): 929-46.

[6]Ministry of Public Health. Treatment protocols of primary liver cancer(2011 edition)[J].ChinClinOncol, 2011,16(10): 929-46.

[7]Zhang Y H, Wu Y Q, Ye S Q,et al. The response to interferon is influenced by hepatitis B virus genotypeinvitroandinvivo[J].VirusRes, 2013, 171(1): 65-70.

[8]楊凱, 管世鶴, 王愛華, 等. 拉米夫定聯(lián)合α干擾素序貫處理增強(qiáng)干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白表達(dá)的研究[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2013, 29(11): 1568-72.

[8]Yang K, Guan S H, Wang A H, et al. Enhancement of interferon-induced transmembrane protein expression in HepG2.2.5 cells sequentially treated with lamivudine and interferon-α[J].ChinPharmacolBull, 2013, 29(11): 1568-72.

[9]陸豫, 黃志紓, 譚嘉恒,等. 大黃素衍生物的合成及細(xì)胞毒性研究[J]. 有機(jī)化學(xué), 2005, 25(8): 944-8.

[9]Lu Y, Huang Z S, Tan J H,et al. Synthesis and cytotoxicity of emodin derivatives[J].ChinJOrgChem, 2005, 25(8): 944-8.

[10]Capranico G, Palumbo M, Tinelli S, et al. Conformational drug determinants of the sequence specificity of drug-stimulated topoisomerase II DNA cleavage[J].JMolBiol, 1994, 235(4): 1218-30.

[11]Glisson B S, Killary A M, Merta P,et al. Dissociation of cytotoxicity and DNA cleavage activity induced by topoisomerase Ⅱ-reactive intercalating agents in hamster-human somatic cell hybrids[J].CancerChemotherPharmacol, 1992, 31(2): 131-8.

[12]Zunino F, Capranico G. DNA topoisomerase II as the primary target of anti-tumor anthracyclines[J].AnticancerDrugDes, 1990, 5(4): 307-17.

[13]Ben D D, Palumbo M, Zagotto G,et al. DNA topoisomerase II structures and anthracycline activity: insights into ternary complex formation[J].CurrPharmDes, 2007, 13(27): 2766-80.

[14]Kim C M, Koike K, Saito I, et al. HBx gene of hepatitis B virus induces liver cancer in transgenic mice[J].Nature, 1991, 351(6324): 317-20.

[15]Yu D Y, Moon H B, Son J K, et al. Incidence of hepatocellular carcinoma in transgenic mice expressing the hepatitis B virus X-protein[J].JHepatol, 1999, 31(1): 123-32.

[16]Yang N, Tang Y, Wang F,et al. Blockade of store-operated Ca2+entry inhibits hepatocarcinoma cell migration and invasion by regulating focal adhesion turnover[J].CancerLett, 2013, 330(2): 163-9.

[17]Bouchard M J, Wang L H, Schneider R J. Calcium signaling by HBx protein in hepatitis B virus DNA replication[J].Science, 2001, 294(5550): 2376-8.

[18]Sells M A, Chen M L, Acs G. Production of hepatitis B virus particles in HepG2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA[J].ProcNatAcadSci, 1987, 84(4): 1005-9.

[19]Sells M A, Zelent A Z, Shvartsman M,et al. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions[J].JVirol, 1988, 62(8): 2836-44.

Synthesis of 8-bromo-ethoxy Rhein and evaluation of its inhibition effect on hepatitis B virus in human hepatoma cells HepG2.2.15

PAN Zhi-yu1, LI Jing1, CHEN Yun-long2,WANG Chun-miao1, PENG Zheng1, SU Zheng-ying1, LI Dan-rong3, HOU Hua-xin1

(1.CollegeofPharmacy，GuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China；2.TsitsiharFirstHospitalofHeilongjiangProvince，TsitsiharHeilongjiang161005，China;3.AffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021，China)

AimTo synthesize 8-bromo-ethoxy Rhein and investigate its mechanisms and inhibition effect on hepatitis B surface antigen(HBsAg) and e antigen(HBeAg)in HepG2.2.15 cells.Methods8-bromo-ethoxy Rhein was synthesized based on the chemical structure of Rhein，and its structure was identified by IR，1H-NMR and13C-NMR spectra.MTT assay was used to test the inhibitory effect of 8-bromo-ethoxy Rhein on HepG2.2.15 cells. After the cells treatment by 8-bromo-ethoxy Rhein, the HBsAg and HBeAg in cell supernatant were detected by ELISA. The expression of hepatitis B virus X gene(HBx) was detected by Western blot. The cell cycles were examined with flow cytometry. The intracellular free calcium concentration was detected by laser scanning confocal microscopy.ResultsThe structure of 8-bromo-ethoxy Rhein was confirmed by IR，1H-NMR and13C-NMR.MTT results showed that synthetic product and Rhein could inhibit the cell proliferation in HepG2.2.15 cells. After treated with 8-bromo-ethoxy Rhein and Rhein for 72 h，the half inhibitory concentration 50%(IC50) was 14.29 mg·L-1and 11.59 mg·L-1, respectively. Using non-cytotoxic dose of 8-bromo-ethoxy Rhein, the inhibitory effect on HBsAg and HBeAg was gradually enhanced with increasing 8-bromo-ethoxy Rhein concentration.The inhibitory effect of synthetic product on hepatitis B virus was better than that of Rhein. 8-bromo-ethoxy Rhein could down-regulate the expression of HBx,intracellular calcium ion concentration and block the hepatitis B virus(HBV) replication. Flow cytometry results showed 8-bromo-ethoxy Rhein didn′t affect the cell cycle.ConclusionsCompare with Rhein, the synthesis of 8-bromo-ethoxy Rhein shows stronger inhibition on hepatitis B virus in HepG2.2.15, and its mechanisms may involve down-regulating the expression of HBx and reducing calcium ion concentration.

8-bromo-ethoxy Rhein;Rhein；human hepatoma cells; hepatitis B virus; HBx; intracellular calcium

2016-04-20,

2016-05-15

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81460561); 廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-壯醫(yī)方藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(No 桂教科研〔2014〕6號)

潘智育(1991-)，女，碩士生，研究方向：分子藥理學(xué)，E-mail: panzhiyu123123@163.com；

侯華新(1960-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：分子藥理學(xué)與藥物化學(xué),通訊作者，E-mail:houhuaxin@163.com

A

1001-1978(2016)08-1175-06

R284.1；R392.11；R373.21；R735.7；R977.6

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-7-19 10:43網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.056.html