孔繁靜　趙　娟

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HP感染的消化性潰瘍伴胃癌前病變與自噬因子的相關(guān)性研究

孔繁靜趙娟

目的探討幽門(mén)螺桿菌(helicobacterpylori，HP)感染伴胃黏膜癌前病變與自噬因子LC3B表達(dá)水平之間的相關(guān)性。方法收集經(jīng)胃鏡及黏膜下活檢確診為消化性潰瘍的患者263例，采用半定量RT-PCR方法檢測(cè)所有患者的自噬因子LC3B 表達(dá)水平，同時(shí)行碳14呼氣試驗(yàn)進(jìn)行HP檢測(cè)，分別比較患者的HP陽(yáng)性檢出率與自噬因子LC3B表達(dá)水平之間的相關(guān)性；以及HP感染的消化性潰瘍伴胃癌前病變與自噬因子LC3B表達(dá)水平之間的相關(guān)度。結(jié)果自噬因子LC3B mRNA 高表達(dá)與HP檢出率呈正相關(guān)；自噬因子LC3B mRNA高表達(dá)與慢性胃炎伴不典型增生組的發(fā)病率呈正相關(guān)。結(jié)論自噬因子LC3B mRNA高表達(dá)與HP感染及消化性潰瘍伴胃黏膜不典型增生具有相關(guān)性。

幽門(mén)螺桿菌；自噬因子；LC3B；幽門(mén)螺旋桿菌檢測(cè)；胃癌前疾病

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.07.007

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1065～1068)

消化性潰瘍是臨床消化系統(tǒng)的常見(jiàn)性疾病，自從幽門(mén)螺旋桿菌發(fā)現(xiàn)以來(lái)，消化性潰瘍與其之間的關(guān)系已被證實(shí)，同時(shí)HP也是胃癌及胃癌前疾病的一個(gè)重要的發(fā)病因素，已有不少關(guān)于HP與胃癌及胃癌前疾病的研究[1-2]。HP感染的消化性潰瘍繼發(fā)的胃黏膜的損傷以及在此基礎(chǔ)上出現(xiàn)的一系列病理改變機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，自噬是其中的一個(gè)重要的病理調(diào)控機(jī)制，在炎癥調(diào)控中扮演著雙重角色。自噬作用可以抑制性因子的激活，通過(guò)清除內(nèi)源性刺激物降低炎性反應(yīng)，同時(shí)在自噬缺失的情況下，內(nèi)源性因子造成炎癥激活，增加炎性反應(yīng)。自噬又是細(xì)胞降解細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的主要途徑，長(zhǎng)期以來(lái)細(xì)胞的自噬又被認(rèn)為是細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)，是細(xì)胞自救的行為，在各類(lèi)炎性反應(yīng)及腫瘤調(diào)控上自噬發(fā)揮著重要的作用。自噬泡膜上的微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3B) 是自噬的標(biāo)志性分子，自噬活動(dòng)在胃黏膜炎性損傷中被激活，同樣調(diào)控著胃黏膜的再生和愈合，自噬的分子機(jī)制也是當(dāng)今消化界研究的熱點(diǎn)之一[3-4]。消化性潰瘍患者根除HP治療成為各大指南的強(qiáng)烈推薦意見(jiàn)，但是自噬調(diào)控與HP感染率以及胃癌前疾病的發(fā)病率之間的關(guān)系研究較少[3]。本研究通過(guò)對(duì)他們之間的相關(guān)性進(jìn)行探討，分析自噬因子的表達(dá)水平與HP感染以及不同類(lèi)型的胃癌前疾病之間關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1一般資料

收集納入了2014年1月至2015年5月期間的在我院消化科確診為消化性潰瘍的患者263例，其中男性148例，女性115例，平均年齡(46.25±10.23)歲，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并簽署知情同意書(shū)。

1.2入組標(biāo)準(zhǔn)

所有納入本研究的患者均符合以下入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡在20～75周歲之間的患者；②均進(jìn)行胃鏡檢查診斷為上消化道潰瘍，包括胃潰瘍、十二指腸球部潰瘍、復(fù)合性潰瘍，其中臨床表現(xiàn)為伴或不伴有活動(dòng)性出血；③入院前1周內(nèi)未服用過(guò)任何護(hù)胃藥及影響幽門(mén)螺旋桿菌檢查結(jié)果的藥物，包括抗生素及中藥，1個(gè)月內(nèi)未服用過(guò)類(lèi)固醇抗炎藥物；④患者沒(méi)有其他各類(lèi)系統(tǒng)的嚴(yán)重疾病及腫瘤；⑤均順利完成胃鏡及鏡下取活檢術(shù)；⑥依從性好，并完成問(wèn)卷調(diào)查。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn)

出現(xiàn)以下情況予以排除：①年齡不滿20周歲，或大于75歲的患者；②有軀體性疾病或者其他系統(tǒng)疾??；③卓-艾氏綜合征、有胃手術(shù)史、胃癌、食管靜脈曲張破裂出血者予以排除；④存在聽(tīng)力、視力疾病，意識(shí)不清或精神疾病，有服用過(guò)精神科藥物病史的患者；⑤有成癮類(lèi)藥物及酒精使用史的患者。

1.4方法

1.4.1胃鏡檢查并取活檢對(duì)納入研究的患者行胃鏡檢查，并在檢查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)患者存在消化性潰瘍，同時(shí)行鏡下取活檢術(shù)，病理組織放入福爾馬林液中待病理科行病理檢查，按照Forrest分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)，記錄潰瘍的形態(tài)、大小等特征。

1.4.2碳14呼氣試驗(yàn)對(duì)所有納入研究的患者在入組后給予空腹口服尿素14C膠囊，服藥30 min后對(duì)其進(jìn)行呼氣試驗(yàn)。應(yīng)用幽門(mén)螺旋桿菌檢測(cè)儀(型號(hào)為：HUBT-01)進(jìn)行HP檢測(cè)，在護(hù)理人員的配合下完成。

1.4.3染色方法對(duì)病理標(biāo)本進(jìn)行HE染色，采用常規(guī)的病理診斷及組織學(xué)分型分類(lèi)分級(jí)。對(duì)判斷為HP陰性的采用Warthin-Starry細(xì)菌染色進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)HP的感染情況以判斷有無(wú)HP感染。

1.4.4HID-AB(pH2.5)-PAS黏液染色[5]唾液酸黏液染藍(lán)色，中性黏液染紫紅色，硫酸黏液染棕黑色。根據(jù)黏液染色及形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)定義各類(lèi)胃癌前疾?。耗c上皮化生，慢性萎縮性胃炎；胃上皮不典型增生。

1.4.5RT-PCR方法檢測(cè)自噬因子LC3B 表達(dá)水平對(duì)納入研究的患者的胃組織采用RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取，采用TaqMan RNA試劑盒檢測(cè)自噬因子LC3B表達(dá)情況。內(nèi)參校正：RT-PCR反應(yīng)每個(gè)樣本量取10 μl的RNA提取量，由于實(shí)驗(yàn)測(cè)試過(guò)程中受到RNA逆轉(zhuǎn)錄效率、RNA濃度定量誤差以及每個(gè)樣品等體積的cDNA的含量不同等系統(tǒng)誤差的影響，我們采用RNU6作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參。對(duì)自噬因子LC3B的表達(dá)水平采用二步法進(jìn)行檢測(cè)，第一步是通過(guò)莖環(huán)引物來(lái)合成互補(bǔ)DNA，再通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)對(duì)10 ng RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)了反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，在PCR管加入10 μl的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，總的RNA濃度調(diào)整到2 ng/μl，最后加入5 μl的逆轉(zhuǎn)錄引物，在冰上混勻之后反應(yīng)5 min，接著進(jìn)行梯度變性反應(yīng)，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min遞減。第二步采用Platinum SYBR Green qPCR的反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為2×的 PCR Taqman Universal的混合液以及Taqman RNA的特異性引物，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行反應(yīng)，cDNA共5 μl加入到RNA的去酶的水當(dāng)中，將體積擴(kuò)增至20 μl，通過(guò)循環(huán)反應(yīng)94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min遞減的擴(kuò)張40個(gè)循環(huán)之后，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，采用實(shí)時(shí)定量反應(yīng)，按照PCR操作說(shuō)明，Ct的檢測(cè)值在20～32之外的需要進(jìn)行第二次檢測(cè)。應(yīng)用△Ct=Ct自噬因子LC3B-CtRNU6的計(jì)算公式計(jì)算自噬因子LC3B的相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有采集的數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件全部數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)文件，將LC3B表達(dá)水平分為2組，小于平均值為低表達(dá)組，大于平均值作為高表達(dá)組。通過(guò)分析LC3B的表達(dá)水平高低與發(fā)病相關(guān)因素分析以逐步回歸法篩選有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量，對(duì)臨床病理因素之間的風(fēng)險(xiǎn)情況采用logistic回歸分析，組間比較用方差分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，組間率的比較用卡方檢驗(yàn)。應(yīng)用Mann-whitney U檢驗(yàn)法進(jìn)行兩兩數(shù)據(jù)之間比較。具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的以P<0.05表示。

2　結(jié)果

2.1LC3B的相對(duì)表達(dá)量與臨床特征之間的相關(guān)性

LC3B的相對(duì)表達(dá)量為0.436，95%CI為0.323～0.534，表達(dá)量低于平均值的有143例，高于平均值的有120例，LC3B相對(duì)表達(dá)量與患者的年齡、性別、發(fā)病的部位及黏膜損傷的大小并不存在相關(guān)性，P>0.05；而與HP感染、胃上皮不典型增生、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生有關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1　LC3B的相對(duì)表達(dá)量與臨床特征的相關(guān)性

2.2LC3B相對(duì)表達(dá)量的高低與臨床因素之間的關(guān)系

采用logistic回歸分析LC3B相對(duì)表達(dá)量的高低與臨床因素之間的相關(guān)性，LC3B相對(duì)表達(dá)量與HP感染具有相關(guān)性，調(diào)整之后風(fēng)險(xiǎn)OR=5.05，95%CI為1.14～23.45，P=0.02，見(jiàn)表2。

表2　LC3B相對(duì)表達(dá)量的高低與臨床因素之間的關(guān)系

3　討論

消化性潰瘍是發(fā)生在胃十二指腸的急慢性潰瘍，是消化系統(tǒng)的常見(jiàn)病和多發(fā)病，其形成的原因具有多樣化的特點(diǎn)，酸性胃液對(duì)黏膜消化作用是消化性潰瘍形成的主要因素[6-8]。幽門(mén)螺旋桿菌是引發(fā)該病發(fā)生的主要環(huán)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)消化性潰瘍與HP感染密切相關(guān)。自從HP被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，對(duì)上消化道的研究一直在不斷的更新和深入，HP通過(guò)損傷上消化道的黏膜層參與疾病的發(fā)生發(fā)展，且HP感染也是引起消化性潰瘍、慢性胃炎、胃癌前疾病甚至胃癌的重要因素，HP感染之后侵犯胃黏膜，使其黏膜屏障的免疫力下降，黏膜變薄且上皮細(xì)胞的類(lèi)型也會(huì)發(fā)生改變，一些癌前疾病隨之發(fā)生，機(jī)體對(duì)HP的自我清除能力也下降，導(dǎo)致HP感染升高，相互影響也在一定程度上提高了上消化道腫瘤的發(fā)生率[9-11]。

自噬是多種組織細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，細(xì)胞通過(guò)降解而形成自噬體，運(yùn)輸?shù)饺苊阁w從而形成自噬溶酶體，并經(jīng)過(guò)酶的降解消化之后實(shí)現(xiàn)某些細(xì)胞器的更新和新陳代謝。近年來(lái)研究結(jié)果顯示自噬貫穿在炎癥和黏膜損傷修復(fù)的整個(gè)過(guò)程，在胃黏膜的修復(fù)中扮演著一個(gè)十分重要的角色。自噬與胃黏膜的細(xì)胞修復(fù)及損傷的相關(guān)性是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)[12-13]。本研究納入243例消化性潰瘍的患者，入組后均行胃鏡檢查及胃鏡下活檢診斷并進(jìn)行碳14尿素呼氣試驗(yàn)方法檢測(cè)，所有納入研究的患者均采用半定量RT-PCR方法檢測(cè)自噬因子LC3B表達(dá)水平，同時(shí)行碳14呼氣試驗(yàn)進(jìn)行HP檢測(cè)，分別比較患者的HP陽(yáng)性檢出率與自噬因子LC3B表達(dá)水平之間的相關(guān)性，以及HP感染的消化性潰瘍伴胃癌前病變與自噬因子LC3B表達(dá)水平之間的相關(guān)度。結(jié)果顯示，LC3B的相對(duì)表達(dá)量為0.436，95%CI為0.323～0.534表達(dá)量低于平均值的有143例，高于平均值的有120例，LC3B相對(duì)表達(dá)量與患者的年齡、性別、發(fā)病的部位及黏膜損傷的大小并不存在相關(guān)性；而與HP感染、胃上皮不典型增生、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生有關(guān)，結(jié)果提示自噬因子LC3B mRNA 高表達(dá)與HP檢出率呈正相關(guān)；自噬因子LC3B mRNA高表達(dá)與慢性胃炎伴不典型增生組的發(fā)病率呈正相關(guān)。HP感染后，導(dǎo)致胃酸對(duì)胃黏膜的損害，使胃黏膜細(xì)胞類(lèi)型變化，腸上皮化生、萎縮性胃炎和不典型增生的胃癌前疾病發(fā)病會(huì)因?yàn)镠P的感染導(dǎo)致胃酸分泌的抑制，同時(shí)HP感染會(huì)產(chǎn)生壁細(xì)胞的抑制蛋白，抑制胃酸分泌，因此自噬因子LC3B mRNA 高表達(dá)、HP感染及胃癌前疾病的發(fā)生三者是相互作用相互影響的。

綜上所述，本研究從自噬的角度對(duì)HP感染及胃癌前疾病進(jìn)行臨床觀察，發(fā)現(xiàn)黏膜的不典型增生及HP感染與自噬因子LC3B mRNA 高表達(dá)存在密切關(guān)系，也初步證明了自噬因子LC3B mRNA高表達(dá)與胃癌前疾病確實(shí)存在著一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果也提示自噬因子LC3B mRNA高表達(dá)對(duì)HP感染及胃癌前疾病具有調(diào)控作用，提示在胃黏膜惡化的形成過(guò)程中，自噬作為胃黏膜修復(fù)的重要機(jī)制，在治療中可選擇LC3B作為基因治療的靶點(diǎn)，本研究也為我們提供了基因治療的新思路。

[1]Takeuchi K，Ohishi M，Ota S，et al.Metabolic profiling to identify potential serum biomarkers for gastric ulceration induced by nonsteroid anti-inflammatory drugs〔J〕.J Proteome Res，2013，12(3)：1399-1407.

[2]劉文忠，蕭樹(shù)東.幽門(mén)螺桿菌新國(guó)際共識(shí)解讀〔J〕.胃腸病學(xué)，2012，17(1)：1-4.

[3]Chen HC，F(xiàn)ong TH，Lee AW，et al.Autophagy is activated in injured neurons and inhibited by methylprednisolone after experimental spinal cord injury 〔J〕.J Spine，2012，37(6)：470-475.

[4]Kato M，Ono S，Yoshida T，et al.Significance of H.pylori eradication in treatment and prevention for low-dose aspirin induced gastric ulcer of elderly〔J〕.Nihon Rinsho，2010，68(11)：2089-2095.

[5]Naqano Y，Matsui H，Tamura M，et al.NSAIDs and acidic environment induce gastric mucosal cellular mitochondrial dysfunction〔J〕.Digestion，2012，85(2)：131-135.

[6]朱玉群，楊紹徐.幽門(mén)螺旋菌感染與胃癌的相關(guān)性研究〔J〕.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，3(17)：49-50.

[7]成積儒，蔡永林，黃德旺，等.336例上消化道疾病患者的幽門(mén)螺桿菌抗體譜檢測(cè)結(jié)果分析〔J〕.廣西醫(yī)學(xué)，2009，31(6)：807-808.

[8]David S，Kroner A.Repertoire of microglial and macrophage responses after spinal cord injury 〔J〕.J Nat Rew Neurosci，2011，12(7)：388-399.

[9]Kanno H，Ozawa H，Sekiguchi A，et al.Induction of autophagy and autophagic cell death in damaged neural tissue after acute spinal cord injury in mice〔J〕.J Spine，2011，36(22)：E1427-1434.

[10]Boike JR，Kao R，Meyer D，et al.Does concomitant use of paracetamol potentiate the gastroduodenal mucosal injury associated with aspirin?A prospective，randomised，pilot study〔J〕.Aliment Pharmacol Ther，2012，36(4)：391-397.

[11]朱敏，袁昌瓊，楊慧英，等.胃腸外疾病患者幽門(mén)螺旋桿菌感染治療探析〔J〕.河北醫(yī)學(xué)，2013，19(12)：1795-1797.

[12]Seo PJ，Kim N，Kim JH，et al.Comparison of indomethacin，diclofenac and aspirin-induced gastric damage according to age in rats〔J〕.Gut Liver，2012，6(2)：210-217.

[13]Tamural I，F(xiàn)ujita T，Tsumura H，et al.Low-dose aspirin-induced gastroduodenal mucosal injury in Japanese patients with arteriosclerotic disease〔J〕.Inter Med，2010，49(23)：2537-2545.

(編輯：甘艷)

Correlation between Precancerous Lesions and Autophagy Factor of HP Infectedwith Peptic Ulcer

KONGFanjing，ZHAOJuan.

JingzhouSecondPeople'sHospital，Jingzhou，434000

ObjectiveTo study the correlation between helicobacterpylori (HP) infection with gastric precancerous lesions and expression of autophagy factor LC3B.Methods263 cases of peptic ulcer patients confirmed by gastroenterology endoscopy and mucosal were selected，all patients included in the study received semi-quantitative RT-PCR method to detect self LC3B bite factor expression levels of carbon-14 breath test simultaneously perform HP detect correlations were compared in patients with HP positive rate of autophagy factor LC3B expression level；and former HP infection with gastric peptic ulcer disease autophagy factor LC3B correlation between the expression level.ResultsThe correlation of autophagy factor LC3B mRNA expression with HP detection rate was positive；autophagy factor LC3B mRNA expression in chronic gastritis with high incidence of dysplasia was positively correlated.ConclusionAutophagy factor LC3B mRNA expression with HP infection and peptic ulcer with gastric dysplasia are relevant.

Helicobacter pylori；Autophagy factor；LC3B；Helicobacter pylori detection；Precancerous disease

434000 湖北省荊州市第二人民醫(yī)院(孔繁靜)；441021 湖北省襄陽(yáng)市中心醫(yī)院(趙娟)

趙娟

R735.2

A

1001-5930(2016)07-1065-04

2015-09-07

2016-01-11)