孫力人　何士方　王　銳

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人參皂苷Rg3對鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞放療增敏的作用研究

孫力人何士方王銳

目的探討人參皂苷Rg3對體外培養(yǎng)鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞放療敏感性的影響。方法采常規(guī)無血清懸浮培養(yǎng)法從鼻咽癌低分化細(xì)胞株CNE-2中篩選出鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞亞群CNE-2S；采隨機(jī)分組法將細(xì)胞分為人參皂苷Rg3組(15 μg/mL)、放療組和人參皂苷Rg3(15 μg/mL)聯(lián)合放療組；人參皂苷Rg3干預(yù)4 h后，將三組細(xì)胞16 Gy放射線照射30 min，然后在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 d、2 d和3 d，再進(jìn)行相關(guān)測定。MTT法檢測各組CNE-2S細(xì)胞增殖抑制率；DAPI染色法檢測各組CNE-2S細(xì)胞凋亡情況，并分析細(xì)胞的光密度和面密度變化；Elisa法檢測各組CNE-2S細(xì)胞SOD水平。結(jié)果1 d、2 d和3 d，人參皂苷Rg3聯(lián)合放療組的細(xì)胞增殖抑制率以及細(xì)胞SOD水平均明顯高于人參皂苷Rg3組和放療組，而細(xì)胞光密度、面密度明顯于人參皂苷Rg3和放療組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論人參皂苷Rg3可顯著提高CNE-2S細(xì)胞的放療敏感性，其促進(jìn)細(xì)胞SOD表達(dá)可能是其作用機(jī)制之一。

人參皂苷Rg3；鼻咽癌；腫瘤干細(xì)胞；增敏

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.07.003

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1053～1055)

鼻咽癌為耳鼻喉科常見病，臨床資料顯示大多數(shù)患者確診時(shí)該病病情已是晚期階段，且常伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[1]；調(diào)查顯示，我國范圍內(nèi)鼻咽癌的5年生存率現(xiàn)已高達(dá)近74%[2]。

研究證實(shí)，中藥可以減輕放療的毒副反應(yīng)，提高鼻咽癌的臨床治療效果[3]。本研究以鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞亞群CNE-2S為研究對象，在體外實(shí)驗(yàn)中檢測人參皂苷Rg3對鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞亞群CNE-2S的放療增敏作用。

1　材料與方法

1.1材料

人參皂苷Rg3(純度96%)由上海陽光試劑有限公司提供；DMEM/F12培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；胰蛋白酶，表皮生長因子，堿性成纖維細(xì)胞生長因子，溴化二甲噻唑二苯四氮唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜均為博士德工程有限公司產(chǎn)品；胎牛血清由杭州四季青公司生產(chǎn)；DAPI和山羊血清購于美國Sigma公司；AD340型酶標(biāo)儀(美國，Beckman Coulter公司)；IX70-S8F型倒置相差顯微鏡(日本，OLYMPUS公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)[4]采用無血清懸浮培養(yǎng)法從鼻咽癌低分化細(xì)胞株CNE-2中篩選出鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞亞群CNE-2S；將CNE-2S 置于無血清DMEM/F12培養(yǎng)液(含2% B-27添加物，20 μg/L bFGF和hEGF，100 U/mL 青霉素)中，于37 ℃，5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換培養(yǎng)液1次，連續(xù)培養(yǎng)7 d；再用胰酶消化，離心，無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1∶2比例進(jìn)行傳代，將細(xì)胞以2×105個(gè)接種于培養(yǎng)孔板進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組采用隨機(jī)分組法將細(xì)胞分為3組：人參皂苷Rg3組(15 μg/mL)，放療組和人參皂苷Rg3(15 μg/mL)聯(lián)合放療組，每組各10孔細(xì)胞；人參皂苷Rg3干預(yù)4 h后，將三組細(xì)胞用16 Gy放射線照射30 min，然后在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 d、2 d和3 d，再進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)測定。

1.2.3MTT法測定細(xì)胞增殖[5]收集對數(shù)生長期CNE-2S細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/孔，置于96孔板，每孔100 μL，每孔加入20 μL MIT液，于5%CO2的飽和濕度和37 ℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h；采用二甲基亞砜(DMSO)振蕩溶解，搖床混勻15 min，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀(波長：490 nm)下測定各孔吸光度值(OD值)，按細(xì)胞抑制率(%)=[(對照組OD 值-治療組OD 值)/對照組OD 值]×100%，算出細(xì)胞增殖抑制率；每次測定重復(fù)3遍，取平均值。

1.2.4CNE-2S細(xì)胞凋亡檢測采用細(xì)胞核(DAPI)染色法測定，首先吸出培養(yǎng)板內(nèi)液體，在每孔內(nèi)加入約DAPI溶液(1∶1500)100 μL，于室溫下繼續(xù)孵育10 min，然后去除DAPI液，漂洗2次，熒光顯微鏡下觀察并拍照；應(yīng)用CMIAS-II 多功能真彩病理圖像分析系統(tǒng)對細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析，每組隨機(jī)挑選10張圖片，每張圖片隨機(jī)挑選10個(gè)視野，測定視野下細(xì)胞的光密度和面密度，每次重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.5細(xì)胞總超氧化物歧化酶(SOD)測定采用Elisa法測定，重復(fù)3次，取平均值，檢測試劑盒由上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司提供。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件包對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料應(yīng)用表示，采用單因素方差分析，P<0.05為比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MTT法檢測各組CNE-2S細(xì)胞增殖抑制率

MTT 法檢測結(jié)果顯示：與人參皂苷Rg3組比較，放療組和人參皂苷Rg3聯(lián)合放療組CNE-2S細(xì)胞增殖抑制率均呈上升趨勢；孵育1 d、2 d和3 d，放療組CNE-2S和人參皂苷Rg3聯(lián)合放療組細(xì)胞增殖抑制率均于單純?nèi)藚⒃碥誖g3組(P<0.01)；且在孵育1 d、2 d和3 d，人參皂苷Rg3聯(lián)合放療組細(xì)胞增殖抑制率高于放療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表 1。

表1　三組CNE-2S細(xì)胞增殖抑制率

注：與同期人參皂苷Rg3組比較，a為P<0.01；與同期放療組比較，b為P<0.01。

2.2DAPI染色法檢測各組CNE-2S細(xì)胞凋亡情況

人參皂苷Rg3組中CNE-2S細(xì)胞核激發(fā)藍(lán)色熒光的細(xì)胞數(shù)量多；放療組中類似細(xì)胞減少；人參皂苷Rg3聯(lián)合放療組中CNE-2S細(xì)胞熒光減少更明顯。與人參皂苷Rg3組比較，放療組和人參皂苷Rg3聯(lián)合放療組細(xì)胞光密度和面密度值均呈下降趨勢；在1 d、2 d和3 d，放療組和人參皂苷Rg3聯(lián)合放療組細(xì)胞光密度和面密度值均小于單純?nèi)藚⒃碥誖g3組(P<0.01)；且在孵育1 d、2 d和3 d，人參皂苷Rg3聯(lián)合放療組細(xì)胞光密度和面密度小于放療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2　三組細(xì)胞光密度和面密度比較±s,n=100)

注：與同期人參皂苷Rg3組比較，a為P<0.01；與同期放療組比較，b為P<0.01。

2.3Elisa法檢測各組CNE-2S細(xì)胞SOD水平

Elisa法檢測CNE-2S細(xì)胞SOD水平結(jié)果顯示：與人參皂苷Rg3組比較，放療組和人參皂苷Rg3聯(lián)合放療組細(xì)胞SOD水平均呈升高趨勢；在孵育1 d、2 d和3 d，放療組和人參皂苷Rg3聯(lián)合放療組細(xì)胞SOD水平均高于單純?nèi)藚⒃碥誖g3組(P<0.01)；且在孵育1 d、2 d和3 d，人參皂苷Rg3聯(lián)合放療組細(xì)胞SOD水平高于放療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表 3。

表3三組CNE-2S細(xì)胞SOD水平比較

組別孵育1d孵育2d孵育3d人參皂苷Rg3組35.44±3.7649.33±4.7251.62±5.65放療組44.61±4.94a53.62±3.91a61.46±6.75a人參皂苷Rg3聯(lián)合放療組51.97±5.41ab60.15±6.13ab70.17±7.31ab

注：與同期人參皂苷Rg3組比較，a為P<0.01；與同期放療組比較，b為P<0.01。

3　討論

人參主要成分為人參皂苷，具有扶正祛邪之功效；國內(nèi)外調(diào)查表明，人參皂苷Rg3的抗腫瘤作用已得到廣泛證實(shí)，如對腸癌、肝癌、骨髓瘤以及黑色素瘤等[6]；近年研究顯示，人參皂苷Rg3可抑制人低分化鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2體外血管生成及其遷移能力[7]；然而，人參皂苷Rg3對鼻咽癌中腫瘤干細(xì)胞的作用或提高其對放療增敏的療效尚不知曉。本研究采取常規(guī)無血清培養(yǎng)方案從鼻咽癌低分化細(xì)胞株CNE-2中篩選出鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞亞群CNE-2S；將CNE-2S 置于無血清DMEM/F12培養(yǎng)液中，于37 ℃5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，獲得所需試驗(yàn)細(xì)胞。

依據(jù)臨床放療增敏劑的選用原則，選取對腫瘤細(xì)胞生長抑制率≤5%的低藥物濃度；選用的低劑量人參皂苷Rg3單純使用對鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的殺傷效應(yīng)并不顯著。結(jié)果顯示，與人參皂苷Rg3和放療組相比，在1 d、2 d和3 d后人參皂苷Rg3聯(lián)合放療能明顯提高細(xì)胞增殖抑制率；DAPI染色法檢測發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3聯(lián)合放療組較人參皂苷Rg3和放療組CNE-2S細(xì)胞的熒光減少更明顯，統(tǒng)計(jì)顯示在1 d、2 d和3 d后人參皂苷Rg3聯(lián)合放療組細(xì)胞光密度和面密度少于人參皂苷Rg3和放療組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，人參皂苷Rg3聯(lián)合放療可明顯提高鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞對放療的敏感性。

研究顯示，體內(nèi)自由基反應(yīng)及其生成物過氧化脂質(zhì)對細(xì)胞膜有損傷作用，因此存在致癌活性[8]；人體正常生理功能下，體內(nèi)產(chǎn)生的自由基可被SOD 等清除，而在自由基反應(yīng)增強(qiáng)情況下SOD 等抗氧化保護(hù)作用被損害，過氧化脂質(zhì)水平顯著升高；因此，SOD與腫瘤的發(fā)生、病程進(jìn)展密切相關(guān)[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與人參皂苷Rg3和放療組比較，在1 d、2 d和3 d，人參皂苷Rg3聯(lián)合放療組細(xì)胞SOD水平明顯高于人參皂苷Rg3和放療組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

綜上所述，人參皂苷Rg3聯(lián)合放療體外干預(yù)鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞可提高細(xì)胞的抑制率，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，故可增強(qiáng)放療的增敏的作用；其促進(jìn)細(xì)胞SOD表達(dá)可能與上述作用有關(guān)。

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(編輯：吳小紅)

Study of Ginsenoside Rg3 on Radiotherapy Sensitivity of Nasopharynx Cancer Stem Cells

SUNLiren,HEShifang,WANGRui.

LuwanBranchofShanghaiRuijingHospital,Shanghai,200020

ObjectiveTo investigate influence of ginsenoside Rg3 on radiotherapy sensitivity of nasopharynx cancer stem cells in vitro.MethodsNasopharyngeal cancer stem cell subset(CNE-2S) was screened out from an undifferentiated epithelial cell line of nasopharyngeal carcinoma(CNE-2S) by conventional serum-free suspension culture method.The study was divided into ginsenoside Rg3 group(15 μg/mL),radiotherapy group and ginsenoside Rg3 combined with radiotherapy group by randomized block method.Relevant experiments were determined after these steps.The 3 groups were at 16 gy radiation during the 30 minutes exposure and then cultivated for 1 day,2 days and 3 days with 4 hours intervention of ginsenoside Rg3.Cellular proliferation inhibition rate of CNE-2S in every group was detected by MTT method.Apoptosis of CNE-2S in each group was measured by DAPI staining method.optical density and area density were analyzed.Level of SOD of CNE-2S in every group was detected by Elisa method.ResultsCellular proliferation inhibition rate and level of SOD of cancer stem cells ginsenoside Rg3 combined with radiotherapy group were obviously higher than those of ginsenoside Rg3 group and radiotherapy group in 1 d,2 d,and 3 d.Optical density,area density of ginsenoside Rg3 combined with radiotherapy group were remarkably lower than those of ginsenoside Rg3 group and radiotherapy group with statistical significances(P<0.01).ConclusionGinsenoside Rg3 can evidently increase radiotherapy sensitivity of CNE-2S cells,and the increasing SOD levels may be one of mechanisms.

Ginsenoside Rg3；Nasopharyngeal cancer；Cancer stem cell；Hypersensitization

200020 上海瑞金醫(yī)院盧灣分院

R739.63

A

1001-5930(2016)07-1053-03

2015-09-07

2016-06-03)