張星星王召軍楊玉雙王道文鄭文明董振營(yíng)，*

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 / 小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心， 河南鄭州 450002；2中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 / 植物細(xì)胞與染色體工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100101；3中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049；4中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所， 海南儋州 571731

利用HMW-GS全缺失突變體快速構(gòu)建Glu-1位點(diǎn)近等滲入系

張星星1，2，**王召軍2，3，**楊玉雙2，4王道文2鄭文明1，*董振營(yíng)2，*

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 / 小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心， 河南鄭州 450002；2中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 / 植物細(xì)胞與染色體工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100101；3中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049；4中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所， 海南儋州 571731

小麥高分子量麥谷蛋白亞基（high molecular weight glutenin subunit， HMW-GS）由Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位點(diǎn)中含有的復(fù)等位基因編碼， 評(píng)價(jià)和優(yōu)化Glu-1位點(diǎn)組合是認(rèn)識(shí)與改良HMW-GS表達(dá)與功能的重要途徑。本研究創(chuàng)制了以小偃81為背景的HMW-GS基因完全缺失突變體DLGlu1。將DLGlu1與加拿大優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥品種Glenlea雜交， 結(jié)合后代幼胚培養(yǎng)與分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)， 在BC3F3種子中快速鑒定出來自Glenlea的 Glu-A1a、Glu-B1al和Glu-D1d位點(diǎn)不同組合的 7種滲入系材料， 可進(jìn)一步發(fā)展成一套完整的 Glu-1位點(diǎn)有差異的近等滲入系。本研究表明， DLGlu1可用于Glu-1位點(diǎn)近等滲入系的快速創(chuàng)制， 對(duì)Glu-1位點(diǎn)功能研究和改良具有重要價(jià)值。

小麥； 高分子量麥谷蛋白亞基； 缺失突變體； 滲入系

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展， 一些模式植物和重要農(nóng)作物基因組相繼被測(cè)序， 并繪制出基因組精細(xì)圖［1-2］。小麥（Triticum aestivum L.， 2n = 42， AABBDD）基因組十分龐大（17 Gb， 約為水稻基因組的 40倍）， 基因組重復(fù)序列比重較高， 同時(shí)攜帶A、B和D三套亞基因組， 因此小麥基因組測(cè)序和功能基因組研究一直是極具挑戰(zhàn)性的工作［3］。最近已經(jīng)通過測(cè)序獲得普通小麥及其近緣物種的基因組草圖［4-6］， 為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)小麥功能基因和加快小麥產(chǎn)量和品質(zhì)育種進(jìn)程提供了新的機(jī)遇。

創(chuàng)制基因缺失突變體是研究基因功能的重要方法之一。采用T-DNA插入和EMS誘變方法， 已得到擬南芥和水稻幾乎每個(gè)基因的缺失突變體， 這些突變體是用來研究相應(yīng)基因功能缺失效應(yīng)的重要材料［7-8］。普通小麥?zhǔn)钱愒戳扼w， 對(duì)大多數(shù)小麥基因而言， 同時(shí)存在6個(gè)同源拷貝， 每2個(gè)拷貝來自同一亞基因組， 理論上只有把每個(gè)基因的6個(gè)拷貝同時(shí)突變才可以造成功能缺失， 這種基因組冗余對(duì)創(chuàng)制小麥基因功能缺失突變體是個(gè)巨大挑戰(zhàn)。然而，基因組冗余特性使小麥基因組可以耐受更高頻率的突變，即可以在一個(gè)較小的突變?nèi)后w內(nèi)檢測(cè)到較多基因的突變，同時(shí)也使得小麥基因組可以耐受更大片段的缺失［9］。如Fitzgerald等［10］通過檢測(cè)4500份小麥離子束輻射誘變M2材料， 共檢測(cè)出9個(gè)TaPFT1基因缺失突變體， 缺失區(qū)間達(dá)到數(shù)十兆堿基。Yang等［11］檢測(cè)了5600份小麥離子束輻射誘變M2材料， 共發(fā)現(xiàn)7個(gè)Glu-1缺失突變體， 缺失范圍對(duì)應(yīng)水稻156～345 kb的區(qū)間。這些結(jié)果說明采用物理誘變方法可以快速創(chuàng)制大片段缺失突變體用于小麥功能基因研究。

相對(duì)于玉米和水稻等作物， 小麥面粉可以制作成面包、饅頭、面條、餅干和糕點(diǎn)等多種食品， 主要是因?yàn)樾←溍娣酆歇?dú)特面筋成分， 賦予面團(tuán)黏彈性和延展性。小麥面筋主要由醇溶蛋白（gliadin）和谷蛋白（glutenin）組成，其中谷蛋白又可以分為高分子量麥谷蛋白（high molecular weight glutenin subunit， HMW-GS）和低分子量麥谷蛋白（low molecular weight glutenin subunit， LMW-GS）兩大類［12］。醇溶蛋白對(duì)形成面團(tuán)的延伸性起主要作用， 而麥谷蛋白是影響面團(tuán)彈性的重要因素， 決定面包烘烤品質(zhì)， 其中HMW-GS與小麥面包烘烤品質(zhì)的關(guān)系尤為密切［12］。HMW-GS的編碼基因位于普通小麥第一部分同源群1A、1B、1D長(zhǎng)臂的Glu-1位點(diǎn)， 分別稱為Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1［13］。每個(gè)Glu-1位點(diǎn)編碼2個(gè)在遺傳上緊密連鎖的HMW-GS亞基， 一個(gè)為分子量較大的 x-型亞基， 一個(gè)為分子量較小的y-型亞基。x-型和y-型亞基蛋白序列均由信號(hào)肽、N-端結(jié)構(gòu)域、中間重復(fù)區(qū)和C-端結(jié)構(gòu)域組成［12-13］。HMW-GS在不同小麥品種中存在著豐富的變異， 這些等位變異不僅造成其表達(dá)及在 SDS-PAGE凝膠電泳的遷移率差異， 也造成它們功能上的差異。如在 Glu-D1位點(diǎn)，Glu-D1d （表達(dá)Dx5和Dy10亞基）功能顯著優(yōu)于Glu-D1a（表達(dá)Dx2和Dy12亞基）［14］。

本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中創(chuàng)制了普通小麥品種小偃 81的離子束輻射誘變?nèi)后w， 篩選到Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1的單缺失突變體， 并在同一遺傳背景下評(píng)價(jià)了3個(gè)同源位點(diǎn)的功能差異［11］。在此基礎(chǔ)上， 我們采用聚合育種技術(shù)獲得了小偃81的Glu-1完全缺失突變體DLGlu1。本研究旨在評(píng)價(jià)DLGlu1作為材料基礎(chǔ)快速獲得不同Glu-1等位滲入系， 并用于Glu-1功能研究的前景。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

將普通小麥品種小偃 81 （1， 14+15， 2+12）分別缺失Glu-A1a、Glu-B1h及 Glu-D1a的突變體 DLGluA1、DLGluB1和DLGluD1［11］相互雜交， 獲得Glu-1完全缺失突變體DLGlu1。Glenlea （2*， 7OE+8， 5+10）是加拿大優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥品種， 攜帶Glu-A1b、Glu-B1al和Glu-D1d優(yōu)異等位變異［15］。普通小麥中國(guó)春及其缺體-四體材料［16］用于分子標(biāo)記的定位驗(yàn)證。

2014年將Glenlea （父本）和突變體DLGlu1 （母本）種植于中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所溫室（北京）， 并進(jìn)行雜交， 利用分子標(biāo)記篩選目標(biāo)單株， 與輪回親本DLGlu1回交至 BC3F1代， 再自交一次； 結(jié)合幼胚培養(yǎng)技術(shù)［17］， 于2015年獲得 BC3F2群體； 隨機(jī)選取3個(gè)位點(diǎn)均為Glenlea基因型（Glu-A1b、Glu-Bal1和Glu-D1d）的3份材料（BC3F2-6、BC3F2-16、BC3F2-56）自交， 產(chǎn)生BC3F3種子， 用于基因分型分析。

1.2 引物設(shè)計(jì)及特異分子標(biāo)記檢測(cè)

利用NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） Glu-A1序列信息和普通小麥中國(guó)春基因組序列信息（http：//plants. ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index）， 根據(jù)Glu-A1轉(zhuǎn)座子插入多態(tài)性開發(fā) Glu-A1特異分子標(biāo)記 Xrj5， 并采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。Glu-B1特異分子標(biāo)記為BxMAR， 位于 Bx基因上游 750 bp核基質(zhì)結(jié)合區(qū)（matrix attachment region， MAR）［18］； Glu-D1特異分子標(biāo)記為Xrj2，位于Glu-D1座位1Dx和1Dy基因之間［19］。Glu-A1、Glu-B1 和Glu-D1特異分子標(biāo)記引物序列及在不同小麥品種中預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物如表1所示。

表1本研究所用的分子標(biāo)記Table 1 Molecular marker primers used in this study

從每個(gè)系取30粒 BC3F3代種子， 用解剖刀切取有胚端的半粒放入營(yíng)養(yǎng)缽發(fā)苗， 在小麥一葉一心期剪取第1片葉， 用CTAB法提取基因組DNA［20］。

PCR總體積為20 μL， 含2× PCR Mix （全式金公司）10 μL、引物各0.5 μL、DNA模板1 μL、雙蒸水8 μL。PCR程序?yàn)?4 °C預(yù)變性5 min； 94℃變性30 s， 60℃退火30 s，72℃延伸50 s， 35個(gè)循環(huán)； 72℃延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠在1× TAE緩沖液中電泳分離PCR產(chǎn)物。所使用DNA分子標(biāo)量為Trans2k Plus DNA Marker （全式金公司）。

用SPSS 18.0軟件對(duì)分子標(biāo)記基因型分離比進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

1.3 小麥HMW-GS的提取和SDS-PAGE

取 BC3F3種子無胚端的半粒， 用錘子砸碎置 1.5 mL離心管中。參照Wan等［21］描述的方法提取HMW-GS， 在10%分離膠上進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 Glu-1特異分子標(biāo)記的多態(tài)性和染色體定位分析

Glu-1特異分子標(biāo)記擴(kuò)增譜帶（圖1）與預(yù)期（表1）一致，其中標(biāo)記Xrj5在含Glu-A1b的Glenlea中擴(kuò)增出882 bp譜帶， 在小偃81和中國(guó)春中的擴(kuò)增譜帶分別為594 bp和719 bp； 標(biāo)記BxMAR在含Glu-B1al的Glenlea中擴(kuò)增出563 bp譜帶， 在小偃81和中國(guó)春中分別擴(kuò)增出800 bp和520 bp譜帶； 標(biāo)記Xrj2在含Glu-D1d的Glenlea中的擴(kuò)增譜帶為428 bp， 中國(guó)春和小偃81攜帶Glu-D1a， 擴(kuò)增產(chǎn)物為1085 bp。

利用中國(guó)春缺體-四體系， 將 Xrj5、BxMAR和 Xrj2分別定位于小麥染色體1A、1B和1D上（圖1）。3個(gè)分子標(biāo)記均為共顯性標(biāo)記， 且在Glenlea和小偃81間存在明顯多態(tài)性（圖1）說明這3個(gè)分子標(biāo)記可以用于Glenlea和小偃81 Glu-1位點(diǎn)的基因型分析。

圖1 3個(gè)分子標(biāo)記的染色體定位及其在Glenlea和小偃81間的多態(tài)性分析Fig. 1 Chromosome assignment of the three molecular markers， and validation of the polymorphism between Glenlea and Xiaoyan 81

2.2 Glenlea不同Glu-1位點(diǎn)滲入系材料的鑒定

由于DLGlu1同時(shí)缺失了Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位點(diǎn)， 因此3個(gè)分子標(biāo)記檢測(cè)DLGlu1均為陰性（圖2）， 在DLGlu1 × Glenlea雜交后代中， 該3個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增出的條帶為來自Glenlea的Glu-A1b、Glu-B1al和Glu-D1d等位位點(diǎn)。

用標(biāo)記Xrj2和Xrj5檢測(cè)BC3F2-6單株后代， 均檢測(cè)出與 Glenlea相同的帶型， 說明 Glu-A1b和 Glu-D1d在BC3F2已經(jīng)純合， 而標(biāo)記BxMAR檢測(cè)結(jié)果存在分離， 因此在 BC3F2-6單株后代中共發(fā)現(xiàn) Glu-A1b+Glu-D1d和Glu-A1b+Glu-B1al+Glu-D1d兩種基因型（表 2）。對(duì)BC3F2-16單株后代的檢測(cè)結(jié)果表明， 共有4種基因型， 分別是Glu-D1d、Glu-A1b+Glu-D1d、Glu-B1al+Glu-D1d和Glu-A1b+Glu-B1al+Glu-D1d （表2）。

對(duì)BC3F2-56單株后代分兩批檢測(cè)， 共60粒種子， 3個(gè)分子標(biāo)記均檢測(cè)到分離， 說明Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位點(diǎn)都是雜合狀態(tài)。檢測(cè)第1批30粒種子發(fā)現(xiàn)5種基因型， 分別是 Glu-A1b、Glu-A1b+Glu-D1d、Glu-A1b+Glu-B1al、Glu-B1al+Glu-D1d和Glu-A1b+Glu-B1al+Glu-D1d，但是沒有發(fā)現(xiàn)Glu-B1al基因型； 從第2批30粒種子中檢測(cè)到 2個(gè) Glu-B1al基因型個(gè)體， 但沒有 Glu-A1b、Glu-B1al、Glu-D1d全部為陰性的材料（表2）。

綜上認(rèn)為， DLGlu1×Glenlea BC3F3群體中存在以小偃81為背景、攜帶Glenlea Glu-1位點(diǎn)的7種滲入系（圖2）。對(duì)BC3F2-6和BC3F2-16單株后代分離比的卡方檢驗(yàn)表明，Glenlea的 Glu-1遺傳行為遵從孟德爾基因獨(dú)立分配和自由組合規(guī)律（表 2）； 由于 BC3F2-56后代個(gè)體觀測(cè)數(shù)較小，未進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Glenlea的Glu-1在所篩選材料的表達(dá)， 提取所檢測(cè)材料籽粒谷蛋白， 采用SDS-PAGE方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)所有材料均有相應(yīng)Glu-1亞基的表達(dá)（圖3）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)， Glu-A1b+Glu-B1al基因型（BC3F3-4）的7OE表達(dá)量略低于2*。

3 討論

HMW-GS的組成是影響小麥加工品質(zhì)的重要因素之一［13］。HMW-GS功能研究的主要手段有構(gòu)建重組自交系或近等基因系研究同一位點(diǎn)不同等位亞基的功能差異［22-23］，創(chuàng)制單位點(diǎn)缺失突變體研究單個(gè)位點(diǎn)的缺失效應(yīng)［11］， 及采用基因沉默或過表達(dá)手段研究單個(gè)HMW-GS亞基的功能［24-25］。這些研究為解析HMW-GS功能提供了重要資料，但是由于每個(gè)Glu-1位點(diǎn)均存在多種等位變異， 需要?jiǎng)?chuàng)制多套材料才能一一對(duì)其開展研究， 同時(shí)受環(huán)境及其他遺傳位點(diǎn)（如 LMW-GS或醇溶蛋白）影響， 來自不同材料的研究有時(shí)會(huì)得到截然相反的結(jié)論［26-27］。有研究表明， 不同Glu-1位點(diǎn)編碼的HMW-GS之間存在一定的上位效應(yīng)［28］，通過構(gòu)建近等基因系或轉(zhuǎn)基因等實(shí)驗(yàn)材料難以消除這些影響。目前， 還沒有一個(gè)較好的用于研究每個(gè)Glu-1位點(diǎn)及每個(gè)Glu-1位點(diǎn)不同等位變異功能的系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)室采用離子束誘變方法獲得 Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1單缺失突變體， 并證明了不同位點(diǎn)缺失在功能效應(yīng)上存在顯著差異［11］。本研究在此基礎(chǔ)上， 采用雜交方法創(chuàng)制了不攜帶任何Glu-1位點(diǎn)的材料DLGlu1。理論上可以通過雜交或者轉(zhuǎn)基因方法將任何Glu-1位點(diǎn)或HMW-GS亞基編碼基因?qū)氲紻LGlu1背景進(jìn)行相關(guān)基因的功能研究。

圖2 以分子標(biāo)記Xrj5、BxMAR和Xrj2檢測(cè)Glenlea Glu-1滲入系基因型Fig. 2 Glu-1 genotyps of Glenlea introgression lines detected with molecular markers Xrj5， BxMAR， and Xrj2

表2 以分子標(biāo)記檢測(cè)3個(gè)BC3F2材料后代基因型分布Table 2 Genotype distribution in the progenies of three BC3F2lines identified by molecular markers

圖3 以SDS-PAGE檢測(cè)Glenlea Glu-1滲入系組成Fig. 3 HMW-GS compositions in the Glenlea introgression lines identified by SDS-PAGE

為進(jìn)一步檢驗(yàn)DLGlu1作為材料載體用于HMW-GS功能研究的潛力和創(chuàng)制不同 HMW-GS滲入系的效率，2014年我們以超強(qiáng)筋小麥Glenlea為父本， DLGlu1為輪回親本開展了回交轉(zhuǎn)育工作， 對(duì)每個(gè)世代的雜交材料均進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇， 大大減少了工作量。所有雜交種均以幼胚培養(yǎng)獲得下一代材料， 兩年時(shí)間即得到 BC3F3材料。從這些材料中檢測(cè)到攜帶 Glenlea的 Glu-A1b、Glu-B1al、Glu-D1d、Glu-A1b+Glu-B1al、Glu-A1b+Glu-D1d、Glu-B1al+Glu-D1d、Glu-A1b+Glu-B1al+Glu-D1d 共7種基因型， 即獲得了一整套以小偃81為遺傳背景、攜帶Glenlea的Glu-1不同亞基組合的滲入系（圖2和圖3）。利用這些材料可以對(duì)2*、7OE+8和5+10功能展開研究， 也可對(duì)HMW-GS全部或者部分缺失在培育低筋小麥的應(yīng)用前景上展開研究。

通過計(jì)算Glenlea×DLGlu1的BC3F3材料分離比（表2），發(fā)現(xiàn)Glu-1的遺傳行為遵從孟德爾基因獨(dú)立分配和自由組合規(guī)律。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)Glenlea的Glu-1編碼的x-型和y-型亞基作為一個(gè)孟德爾單位共遺傳（圖3）。有意思的是， 發(fā)現(xiàn)攜帶Glenlea的 Glu-A1b+Glu-B1al材料中 2*亞基表達(dá)量略高于 7OE（圖 3）， 推測(cè)這是由于該材料在Glu-A1位點(diǎn)純合， Glu-B1位點(diǎn)雜合造成的劑量效應(yīng)。李保云等［29］曾報(bào)道， 采用 SDS-PAGE方法發(fā)現(xiàn)在正交和反交雜種F1中HMW-GS表達(dá)雙親所有的全部亞基， 但表達(dá)量不同， 母本譜帶的表達(dá)量多， 父本譜帶的表達(dá)量少。這種現(xiàn)象與小麥的雙受精和三倍體胚乳形成時(shí)來源于母本和父本的遺傳物質(zhì)比例不同（母本占2/3， 父本占1/3）所造成的基因劑量效應(yīng)有關(guān)［29］。本研究中攜帶Glu-1位點(diǎn)的材料作父本， 如果Glu-A1b純合， 而Glu-B1al雜合， 則7OE的理論表達(dá)量為2*的1/3， 這可能是SDS-PAGE凝膠中7OE的譜帶略淺于2*的原因之一。

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Rapid Development of Glu-1 Locus Near-isogenic Introgression Lines Using HMW-GS Deletion Mutant

ZHANG Xing-Xing1，2，**， WANG Zhao-Jun2，3，**， YANG Yu-Shuang2，4， WANG Dao-Wen2， ZHENG Wen-Ming1，*， and DONG Zhen-Ying2，*1State Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science / Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops， College of Life Science， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China；2State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Engineering， Institute of Genetics and Developmental Biology， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100101， China；3University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China；4Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou 571731， China

Wheat （Triticum aestivum L.， AABBDD） high molecular weight glutenin subunits （HMW-GS） were encoded by the genes located in Glu-A1， Glu-B1， and Glu-D1 loci. Evaluation and optimization of the combination of HMW-GS are very important to understand Glu-1 functions. In this study， we constructed a HMW-GS deletion mutant， DLGlu1 with Xiaoyan 81 background， and crossed it with Glenlea， a Canada elite wheat variety with superior end-use quality. Combining the technologies of wheat embryo culture and molecular marker-assisted selection （MAS）， we obtained seven introgression lines containing Glenlea Glu-A1a， Glu-B1al， and Glu-D1d loci， which can be developed as a complete set of near-isogenic introgression lines possessing Glenlea different HMW-GS genes. Our study indicated that the Glu-1 deletion mutant DLGlu1 is of great value in the fast development of Glu-1 near-isogenic introgression lines and the study and utility of wheat Glu-1.

Wheat； HMW-GS； Deletion mutant； Introgression lines

10.3724/SP.J.1006.2016.01247

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31300280）和國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目（2013CB127702）資助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China （31300280） and the National Key Basic Research Program of China （2013CB127702）.
*

（Corresponding authors）： 鄭文明， E-mail： wmzheng@henau.edu.cn； 董振營(yíng)， E-mail： zhydong@genetics.ac.cn
**同等貢獻(xiàn)（Contributed equally to this work）

聯(lián)系方式： E-mail： xingzhang.1989@163.com
Received（

）： 2016-02-22； Accepted（接受日期）： 2016-05-09； Published online（網(wǎng)絡(luò)出版日期）： 2016-06-02.
URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160602.1435.008.html