強(qiáng)治全梁雅珺于正陽杜 婭張 帥朱維寧張林生，*

1西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 / 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西楊凌712100；2西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 陜西西安710069

小麥wzy2-1基因的克隆及功能分析

強(qiáng)治全1梁雅珺1于正陽1杜 婭1張 帥1朱維寧2張林生1，*

1西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 / 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西楊凌712100；2西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 陜西西安710069

脫水素是一類植物胚胎發(fā)育后期豐富蛋白（late embryogenesis abundant protein， LEA蛋白）， 屬于LEA D-11家族，植物受非生物脅迫會大量表達(dá)。利用同源克隆技術(shù)， 從鄭引1號小麥中克隆了1個(gè)Kn型脫水素基因， 命名為wzy2-1。該基因全長1740 bp， 編碼579個(gè)氨基酸， 含有9個(gè)保守的K片段， 與大麥的Dhn5基因具有較高同源性。生物信息學(xué)預(yù)測該蛋白屬于高度親水性的無序蛋白。通過該蛋白對大腸桿菌的保護(hù)作用研究表明， WZY2-1蛋白能夠提高大腸桿菌對低溫、高溫、高鹽以及高滲脅迫的耐受性。熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析表明， wzy2-1基因受低溫、鹽漬、干旱誘導(dǎo)表達(dá)， 但不受外源ABA誘導(dǎo)， 說明wzy2-1基因?qū)儆诜茿BA依賴型脫水素基因。

小麥； 脫水素； 熒光實(shí)時(shí)定量PCR； 原核表達(dá)

植物賴以生存的環(huán)境并不總是適合植物生長。干旱、鹽漬、低溫、高溫等都會影響植物生長發(fā)育， 嚴(yán)重時(shí)會導(dǎo)致植物死亡。為了適應(yīng)各種逆境脅迫， 植物在進(jìn)化過程中，已經(jīng)形成了多種生理生化機(jī)制， 以抵御不利環(huán)境因素， 通常在逆境脅迫下， 植物會積累一系列逆境相關(guān)蛋白， 如胚胎發(fā)育后期豐富蛋白（late embryogenesis abundant protein，LEA）、分子伴侶、解毒酶等［1］。其中， LEA蛋白對提高植物的逆境脅迫耐受性具有非常重要的作用。

LEA蛋白是胚胎發(fā)生后期大量積累的一類蛋白， 最早發(fā)現(xiàn)于胚胎發(fā)育后期的棉花子葉中［2］。LEA蛋白的共同特點(diǎn)是含有大量極性氨基酸， 其中賴氨酸和甘氨酸含量最高， 具有較強(qiáng)的親水性和熱穩(wěn)定性［3］。LEA蛋白是一大類逆境響應(yīng)蛋白， 根據(jù) LEA蛋白氨基酸序列的同源性分為6個(gè)家族， 即LEA-D19 （1族）、LEA-D11 （2族， 又稱脫水素）、LEA-D7 （3族）、LEA-D113 （4族）、LEA-D29 （5族）和LEA-D95 （6族）， 后兩族為附加族［4］。

脫水素屬于LEA2家族， 是目前研究較為深入的一類LEA蛋白［5］， 根據(jù)脫水素保守序列， 可以分為 YnSKm、Kn、KnS、SKn和YnKm共5個(gè)亞類。該類蛋白的特點(diǎn)是含有3個(gè)保守的區(qū)域， 分別是K、Y和S片段。其中， K片段富含賴氨酸， 是所有脫水素共有的， 一般由 15個(gè)氨基酸殘基組成（EKKGIMDKIKEKLPG）［6］； K片段可以形成兩親性的α-螺旋， 在植物失水情況下， 兩親性的α-螺旋可以保持細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)蛋白的穩(wěn)定性［7］。S片段是一段富含絲氨酸的保守序列（SSSSSS）， 可被磷酸化， 并可能與脫水素的入核有關(guān)［8-9］。Y片段的保守序列為（VT）DEYGNP，但目前尚不清楚其功能。除了這3個(gè)保守的序列外， 脫水素還有另外一些保守區(qū)域， 這些區(qū)域富含極性氨基酸， 稱作Φ片段， 通常分布于K片段之間， 可能與參與細(xì)胞質(zhì)組分的相互作用有關(guān)［10］。

近些年對于脫水素的研究有了許多重要發(fā)現(xiàn)。將小麥DHN5 （YSK2）轉(zhuǎn)入大腸桿菌中， 發(fā)現(xiàn) DHN5可以提高大腸桿菌的耐逆性， 這可能與 DHN5可以防止大腸桿菌體內(nèi)的蛋白聚集有關(guān)， 并且發(fā)現(xiàn)DHN5能夠保護(hù)LDH酶和葡萄糖苷酶的活性［11-12］。通過對小麥WZY2和DHN5 K片段的缺失， 發(fā)現(xiàn)K片段在提高大腸桿菌耐逆性和LDH等酶活保護(hù)中起著最主要的作用［13］。當(dāng)植物遭受低溫、干旱、鹽漬等逆境時(shí)， 體內(nèi)會大量積累脫水素蛋白， 例如，小麥 WCOR410［14］、擬南芥 COR15［15］、馬鈴薯 CI7［16］均可響應(yīng)低溫脅迫； 大麥DHN5可以響應(yīng)干旱、低溫和鹽漬脅迫［17］； 對辣椒的CaDHN1研究表明， CaDHN1可以響應(yīng)低溫、鹽和水楊酸脅迫， 但不響應(yīng)ABA誘導(dǎo)［18］。本研究通過同源克隆， 從鄭引1號小麥中成功克隆了小麥Kn型脫水素基因wzy2-1， 對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析， 并且研究了不同脅迫下的wzy2-1表達(dá)模式以及WZY2-1蛋白對大腸桿菌的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料和脅迫處理

小麥品種鄭引1號， 由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。將小麥種子經(jīng) 75%酒精消毒 2 min，蒸餾水浸泡6 h， 置培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光/暗16 h/ 8 h， 晝/夜溫度25℃/19℃。當(dāng)小麥長到二葉一心期時(shí)， 分別進(jìn)行干旱（10%的PEG-6000）、低溫（4℃培養(yǎng)箱）、鹽（500 mmol L-1NaCl溶液）和外源ABA （100 μmol L-1ABA溶液）處理。在處理0、12、24、36、48和60 h取樣， 液氮速凍后保存于-80℃。

1.2 小麥RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

取干旱處理 2 d小麥葉片， 在液氮中研磨， 按照TRIzol試劑（Invitrogen）的操作說明， 提取小麥幼苗總RNA。以提取的 RNA 為模板， 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （TaKaRa）的操作說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3 目的基因全長cDNA克隆

根據(jù)大麥 DNH5 （GenBank登錄號為 AF181455）的cDNA序列設(shè)計(jì)引物（F1： 5′-ATGCACGACGCCGAC-3′；R1： 5′-TTAGTTCAGTCCAGGC-3′）， 以小麥cDNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系 20 μL， 包含 2×Taq PCR Supermix （全式金公司） 8 μL， cDNA模板1 μL， 上、下游引物各1 μL， ddH2O 9 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s， 63℃ 30 s， 72℃ 1 min， 35個(gè)循環(huán)； 72℃ 10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收（天根公司）， 連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞， 涂板， 挑單克隆， 菌液PCR檢測，送3個(gè)陽性菌落到上海生工生物工程有限公司測序。

1.4 目的基因的生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN分析wzy2-1基因序列及蛋白序列； 通過 Blast， 利用 MEGA5.0對 wzy2-1進(jìn)行同源性分析。利用ExPAsy軟件（http：//web.expasy.org/protscale/）對WZY2-1蛋白進(jìn)行疏水性預(yù)測； 利用 Metaprediction軟件（http：// iimcb.genesilico.pl/metadisorder/metadisorder.html）對 WZY2-1蛋白無序化程度進(jìn)行分析［13，19］。

1.5 目的基因的原核表達(dá)及Western blot驗(yàn)證

設(shè)計(jì)含有 Xho I和 BamH I酶切位點(diǎn)的引物（F：5′-CGCGGATCCATGCACGACGCCGAC-3′； R： 5′-CCGCT CGAGTTAGTTCAGTCCAGGC-3′）， 以 pMD18-T-wzy2-1質(zhì)粒為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增， 回收產(chǎn)物， 然后對產(chǎn)物和pET28a質(zhì)粒酶切。酶切體系20 μL， 含PCR產(chǎn)物或pET28a質(zhì)粒10 μL， Xho I 1 μL， BamH I 1 μL， 10×K buffer 2 μL，ddH2O 6 μL。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收， 再將回收的 PCR產(chǎn)物和pET28a質(zhì)粒進(jìn)行16℃連接， 轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞， 涂板， 挑單克隆， 雙酶切檢測， 選 3個(gè)陽性菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體pET28a-wzy2-1轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 （DE3）， 經(jīng)0.2 mmol L-1IPTG誘導(dǎo)0、2、4、6、8 h， 收集3 mL菌體， 10 000×g離心2 min， 加入1 mol L-1Tris-HCl 100 μL和 2×蛋白loading buffer 100 μL， 在沸水浴中煮10 min， 冰上冷卻， 10 000×g離心10 min， 取上清液10 μL進(jìn)行SDS-PAGE檢測， 并且用K片段抗體進(jìn)一步驗(yàn)證［20-21］。

1.6 WZY2-1蛋白對大腸桿菌的耐逆性實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn) pET28a-wzy2-1和 pET28a空載體的大腸桿菌BL21 （DE3）接種到50 mL液體LB中， 于37℃搖床培養(yǎng)至OD值為0.6， 再加入0.2 mmol L-1IPTG誘導(dǎo)2 h。取該誘導(dǎo)菌液1 mL， 加入含10% PEG-6000、500 mmol L-1NaCl 或500 mmol L-1KCl的50 mL液體LB中， 測定波長600 nm下每小時(shí)的菌液OD值， 以無處理的菌液作對照。

采用涂板技術(shù)法進(jìn)行目的基因表達(dá)蛋白對大腸桿菌的溫度耐逆性分析。對IPTG誘導(dǎo)2 h的重組菌和空菌進(jìn)行45℃ 30 min或者-20℃ 2 h的處理， 然后稀釋1000倍，于37℃過夜， 統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)， 以無脅迫處理作對照， 計(jì)算菌存活率［11，22］。

1.7 不同脅迫處理的實(shí)時(shí)定量PCR分析

提取不同處理的小麥樣品 RNA， 以小麥 β-actin （KC775780.1）為內(nèi)參基因進(jìn)行定量RT-PCR分析。引物序列為wzy2-1-F： 5′-CGGAGTGACCGATAAGG-3′， wzy2-1-R： 5′-TGCCAGTTGTTTCGTTGT-3′； actin-F： 5′-TCCAATC TAGGGATACACGC-3′， actin-R： 5′-TCTTCATTAGATTAT CCGTGAGGTC-3′。反應(yīng)體系25 μL， 包括2×SYBR Premix 12.5 μL， 模板2 μL， 上、下游引物各1 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s， 然后95℃ 5 s， 55℃， 20 s， 39個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆

以干旱處理 24 h的小麥 RNA為模板， 反轉(zhuǎn)錄得到cDNA， 利用合成的特異引物F1/R1擴(kuò)增得到1740 bp的產(chǎn)物?；厥赵摦a(chǎn)物， 并連接到pMD18-T載體上， 轉(zhuǎn)入大腸桿菌 TOP10中。通過對陽性菌落測序， 得到完整開放閱讀框序列， 定名為wzy2-1基因， 提交到GenBank， 登錄號為KU230444。

2.2 wzy2-1基因的生物信息學(xué)分析

利用 DNAMAN軟件分析表明， wzy2-1編碼產(chǎn)物由579個(gè)氨基酸組成， 其分子量約為60.3 kD， 等電點(diǎn)為5.8；該蛋白含有9個(gè)保守的K片段基序， 屬于典型的Kn型脫水素（圖1）。利用MEGA5.0構(gòu)建了wzy2-1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹， 發(fā)現(xiàn)wzy2-1和大麥的脫水素基因Dhn5具有較高的同源性（圖 2）。利用 ExPAsy軟件（http：//web.expasy.org/ protscale/）分析表明， WZY2-1蛋白平均疏水系數(shù)為-1.307（圖3）， 具有較強(qiáng)的親水性。用Metprediction （http：//iimcb. genesiico.pl/metadisorder/metadisorder.html）軟件分析表明，WZY2-1蛋白是無序狀蛋白（圖 4）。以上結(jié)果顯示，WZY2-1蛋白在生理?xiàng)l件下是一種高度親水性的無序蛋白， WZY2-1蛋白屬于IDPs家族。

圖1 wzy2-1基因編碼的氨基酸序列Fig. 1 Amino acid sequence of wzy2-1 gene

2.3 wzy2-1基因的原核表達(dá)以及Western blot驗(yàn)證

構(gòu)建了pET28a-wzy2-1原核表達(dá)載體， 并用0.2 mmol L-1IPTG誘導(dǎo)重組菌 BL21 （DE3）， 通過對熱溶性蛋白SDS-PAGE電泳檢測， 發(fā)現(xiàn)在100 kD附近有一條帶， 比預(yù)測的結(jié)果偏大， 這可能是 K片段與蛋白膠的特殊作用導(dǎo)致電泳條帶略滯后移。Western blot驗(yàn)證結(jié)果顯示， 該條帶是WZY2-1重組蛋白（圖5）。

圖2 小麥wzy2-1基因編碼區(qū)與多種植物脫水素基因的遺傳進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of wzy2-1 and other dehydrin genes from different plant species

圖4 WZY2-1蛋白無序化程度預(yù)測Fig. 4 Disorder prediction of WZY2-1 protein

圖5 用K片段抗體進(jìn)行Western blot驗(yàn)證Fig. 5 Western blot with K-fragment antibody

2.4 WZY2-1蛋白對大腸桿菌的耐逆性

在正常條件下， 重組菌和對照菌生長情況基本一致，但在10% PEG-6000、500 mmol L-1NaCl和500 mmol L-1KCl處理后， 重組菌表現(xiàn)出較好的生長趨勢（圖 6）， 說明WZY2-1蛋白能夠提高大腸桿菌對逆境脅迫的耐受性。分別將對照菌和重組菌進(jìn)行45℃ 30 min和-20℃ 2 h處理，結(jié)果表明， 重組菌的存活率顯著高于對照菌（圖 7）， 說明重組菌對溫度脅迫有較高的耐受性。

圖6 不同處理?xiàng)l件下重組菌（wzy2-1）和對照菌（Epet）的生長曲線Fig.6 Growth of recombinant （wzy2-1） and control E. coli （Epet） under different treatments

圖7 重組菌（wzy2-1）和對照菌（Epet）在經(jīng)45℃ 30 min和-20℃2 h處理后的存活率Fig. 7 Survival rate of recombinants （wzy2-1） and control E.

2.5 不同脅迫處理下wzy2-1表達(dá)的定量RT-PCR分析

在冷脅迫處理下， wzy2-1基因表達(dá)量在12 h達(dá)到最高，為對照的30倍； 在鹽脅迫處理下， wzy2-1基因的表達(dá)量在36 h達(dá)到最高， 是對照的30倍； 然而在干旱脅迫下， 直到48 h wzy2-1的表達(dá)量才達(dá)到峰值， 是對照的8倍（圖8）。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)， 在 ABA處理?xiàng)l件下， wzy2-1基因表達(dá)量在60 h內(nèi)沒有明顯上調(diào)的趨勢（圖8）。推測wzy2-1基因?qū)儆诜茿BA依賴型的冷、滲透、干旱響應(yīng)的脫水素基因。

圖8 不同脅迫處理下小麥葉片wzy2-1基因的表達(dá)模式Fig. 8 Transcript accumulation of wzy2-1 in wheat leaves in response to different abiotic stresses as determined by qRT-PCR

3 討論

植物在生長過程中會產(chǎn)生一系列應(yīng)對非生物脅迫的機(jī)制， 像上調(diào)某些基因的表達(dá)以適應(yīng)外界多變的環(huán)境。LEA蛋白就是其中之一， 它能夠提高植物對干旱、鹽漬、低溫等逆境脅迫的耐受性。脫水素具有的 K片段能形成A2型雙親性 α-螺旋， 能與囊泡膜、酸性磷脂、磷脂雙分子層結(jié)合， 提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性， 提高植物對不利環(huán)境的耐受性［24-26］。小麥wzy2-1基因含有9個(gè)保守的K片段， 分子量為60.3 kD， 等電點(diǎn)為5.8， 屬于Kn型酸性脫水素。具有較強(qiáng)的親水性和高度的無序化， 這種高度親水性的無序蛋白在細(xì)胞失水情況下表達(dá)， 對于細(xì)胞水分子有較強(qiáng)的束縛能力， 以利保護(hù)細(xì)胞免于逆境下過度失水而發(fā)生膜的損傷［27］。

研究表明， 脫水素可能具有分子伴侶、防凍劑、離子緩沖劑、膜的穩(wěn)定劑、抗氧化劑等功能［21］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， WZY2-1蛋白能夠提高大腸桿菌對低溫、高溫、高鹽以及高滲脅迫的耐受性（圖6和圖 7）， 脫水素能夠提高大腸桿菌對逆境脅迫的耐受性， 這為后續(xù)轉(zhuǎn)基因相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

植物響應(yīng)非生物脅迫依賴于一系列的信號途徑， 包括ABA依賴型和非ABA依賴型［23，28-29］。在本研究中， 低溫、干旱、鹽漬脅迫處理誘導(dǎo) wzy2-1基因上調(diào)表達(dá)， 但是基因?qū)Ω髅{迫處理的敏感程度不盡相同。低溫脅迫12 h wzy2-1基因表達(dá)至峰值， 而鹽脅迫 36 h基因表達(dá)才到峰值； 干旱脅迫48 h， 基因表達(dá)量比對照上調(diào)8倍， 與低溫和鹽脅迫上調(diào) wzy2-1表達(dá)量 30倍有較大差距。可見，wzy2-1對各種脅迫的敏感程度為低溫＞鹽漬＞干旱。這與以前報(bào)道結(jié)果相似， 即Kn型脫水素主要響應(yīng)低溫脅迫［17，30］。ABA處理60 h未引起wzy2-1基因表達(dá)量明顯變化（圖8）， 因此我們認(rèn)為， wzy2-1可能屬于非ABA依賴型脫水素基因。

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Cloning and Functional Analysis of wzy2-1 Gene in Wheat

QIANG Zhi-Quan1， LIANG Ya-Jun1， YU Zheng-Yang1， DU Ya1， ZHANG Shuai1， ZHU Wei-Ning2， and ZHANG Lin-Sheng1，*1College of Life Science / State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas， Northwest A&F University， Yangling 712100， China；2College of Life Science， Northwest University， Xi’an 710069， China

Dehydrins （DHNs） are identified as the group II of LEA proteins and involved in plant abiotic stress tolerance. In this study， we isolated a novel Kn-type dehydrin gene from wheat cultivar Zhengyin 1， which was designated wzy2-1. The full length of wzy2-1 is 1740 bp， encoding 579 amino acids and containing nine conserved K-fragments. Sequence alignment indicated that wzy2-1 had high homology to Dhn5 gene in Hordeum vulgare. The WZY2-1 protein was predicted to be a highly-hydrophilic and disordered protein. The WZY2-1 protein was successfully expressed in E. coli strain BL21 （DE3）. We found that WZY2-1 protein improved the tolerance to low or high temperature， salt and osmotic stresses in E. coli. The qRT-PCR assay indicated that the expression of wzy2-1 gene was induced by low temperature， PEG， and salt stresses rather than ABA. Thus， we conclude that wzy2-1 is an ABA-independent gene.

Wheat； Dehydrins； Real-time PCR； Procaryotic expression

10.3724/SP.J.1006.2016.01253

本研究由高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20120204110033）和旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目（CSBAA2015007）資助。This study was supported by the Projects for Doctoral Research Funding in Higher Education Institutions Function and Structure of Dehydrin Protein in Different Water Content （20120204110033） and the Foundation of State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas of Northwest A&F University （CSBAA2015007）.
*

（Corresponding author）： 張林生， E-mail： linszhang@nwsuaf.edu.cn， Tel： 029-87092379

聯(lián)系方式： E-mail： qiangsir0934@qq.com
Received（

）： 2016-01-23； Accepted（接受日期）： 2016-05-09； Published online（網(wǎng)絡(luò)出版日期）： 2016-06-02.
URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160602.1442.010.html