李　梅，王耀帥，王應越南京中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，江蘇南京210023

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溫和灸對大鼠后三里穴局部形態(tài)及CGRP、SP、VIP表達的影響*

李梅，王耀帥△，王應越
南京中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，江蘇南京210023

目的：探討溫和灸對大鼠后三里穴施灸局部的溫通效應及生物學基礎。方法：以高脂血癥模型大鼠后三里穴為觀察對象，運用HE染色法和免疫組化法，觀察溫和灸熱刺激下，后三里穴局部皮膚形態(tài)結構以及皮膚組織中降鈣素基因相關肽（CGRP）、P物質（SP）、血管活性腸肽（VIP）表達的變化。結果：溫和灸組與對照組比較，后三里穴局部皮膚組織形態(tài)結構明顯發(fā)生變化，角化層極薄或消失，表皮層斷裂不完整，真皮層膠原纖維排列疏松；施灸后穴位局部皮膚CGRP較多表達在真皮層結締組織，SP較多表達在毛囊，VIP較多表達在真皮層結締組織以及表皮中。結論：溫和灸熱刺激可以改變后三里穴局部形態(tài)結構、影響后三里穴局部皮膚中CGRP、SP、VIP的分布表達，這些效應可能與艾灸以溫促通的生物學基礎相關。

溫和灸；后三里；降鈣素基因相關肽；P物質；血管活性腸肽

艾灸是以艾為主要材料，點燃后在體表穴位或病變部位燒灼、溫熨，借助其溫熱刺激作用，起到溫通氣血、扶正祛邪等防病保健的功效［1-3］。體表皮膚是艾灸刺激的直接作用部位，局部皮膚適宜溫熱刺激的選擇、刺激的反應特征及啟動相關調節(jié)機制的過程均以皮膚的生物學特征為基礎，也就是說研究艾灸的效應規(guī)律和作用原理，并不是只研究艾灸本身的特征，還要研究它的作用對象的特征。本研究以高脂血癥大鼠為模型，觀察溫和灸熱刺激對后三里穴施灸局部皮膚的形態(tài)，以及局部皮膚降鈣素基因相關肽（CGRP）、P物質（SP）、血管活性腸肽（VIP）等神經(jīng)肽陽性表達的影響，探討溫和灸局部的溫通效應及以溫促通作用的生物學基礎。

1　材料與方法

1.1實驗動物選用雄性SD大鼠，體質量（180± 10）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2007-0005，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心（清潔級），采取高脂飼料喂養(yǎng)8周，造成高脂血癥大鼠模型。

1.2實驗器材定制直徑7 mm動物用清艾灸條（南陽漢醫(yī)艾絨有限責任公司）、液狀石蠟、中性樹膠（均由上海標本模型廠提供）、甲醛、二甲苯、無水乙醇（均由南京寧試化學試劑有限公司提供）、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽抗原修復液、DAB顯色試劑盒（均由福州邁新生物技術開發(fā)有限公司提供）、兔抗大鼠CGRP多克隆抗體、兔抗大鼠SP多克隆抗體、兔抗大鼠VIP多克隆抗體（均由武漢博士德生物技術有限公司提供）。TP1020型全自動組織處理儀（由德國LEICA公司提供）、RM2145型石蠟切片機（由德國LEICA公司提供）、BX60型光學顯微鏡（由日本OLYMPUS公司提供）、DP71型圖像獲取系統(tǒng)（由日本OLYMPUS公司提供）、CMIAS98A型圖像分析儀（由北京航空航天大學提供）、圖像分析軟件（由南京大學捷達公司提供）。

1.3實驗方法

1.3.1實驗分組將造模成功的大鼠隨機分為對照組和溫和灸干預組，每組8只。

1.3.2干預方法造模成功后，溫和灸組大鼠施以10 min/d，共2周的溫和灸治療。將大鼠雙側后三里穴區(qū)1 cm×2 cm鼠毛剪除，暴露局部皮膚組織，酒精棉球消毒。用自制固定夾仰臥位固定大鼠，待大鼠安靜不掙扎后，使用直徑7 mm的艾條，以大鼠無掙扎行為的距離調節(jié)艾條與皮膚的距離，施灸于后三里穴進行治療。后三里穴位于膝關節(jié)后外側，腓骨小頭下約5mm處［1］。治療期間，對照組以同樣方法抓取固定，不做艾灸治療。實驗期間所有大鼠同等條件下喂養(yǎng)。

1.3.3HE染色及免疫組化完成治療后，禁食12小時后，取血、取材。取大鼠后三里穴局部長8 mm、寬6 mm、厚3 mm的組織，使標記點在正中間，用預冷的4℃生理鹽水沖洗后，放入10%甲醛中固定。將固定好的皮膚組織進行修塊石蠟包埋。HE染色：石蠟切片脫蠟脫水；蘇木素染液染色5分鐘；快速放入1%鹽酸乙醇中進行分化；用清水洗滌后，放入促反藍液中10分鐘；返藍結束后，梯度酒精上行脫水；二甲苯透明；樹膠封片。免疫組化：取石蠟切片，置烤箱60℃2小時以使切片緊密黏附。二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水，PBS洗，3分鐘×3次；3%H2O2室溫孵育10分鐘，以滅活內源性過氧化物酶；檸檬酸鹽抗原修復液室溫孵育20分鐘；滴加5%BSA封閉液，室溫10分鐘，甩去多余液體，不洗；滴加兔抗鼠CGRP（SP、VIP）多克隆抗體，置37℃溫箱孵育1.5小時。0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；滴加生物素化羊抗兔IgG，置37℃溫箱孵育45分鐘；0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；DAB顯色，蒸餾水洗滌；蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片。

1.3.4圖像采集指標觀測用光學顯微鏡觀察玻片上組織的形態(tài)，找到有效信息，CGRP、SP、VIP陽性顯色為棕黃色或棕褐色顆粒，再用攝像儀進行圖像的拍攝，拍攝倍數(shù)為10×10，然后用圖像分析儀及形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)將獲取的圖像信息進行處理分析。

2　結果

2.1H E染色對照組后三里穴位局部角化層薄，表皮結構完整，基底層、棘層以及顆粒細胞層都未見異常改變，連續(xù)真皮層結構正常，膠原纖維束排列致密，染色呈鮮明紅色，其間可見毛囊、皮脂腺分布，皮下組織結構正常（圖1A）。溫和灸組施灸局部皮膚組織形態(tài)結構明顯發(fā)生變化，角化層極薄或消失，表皮層斷裂不完整，真皮層膠原纖維排列疏松（圖1B）。

圖1　后三里穴局部皮膚形態(tài)結構（HE染色，×100）

2.2免疫組化CGRP、SP、VIP陽性顯色為棕黃色或棕褐色顆粒，信號越強則顏色越深。對照組皮膚組織中可見CGRP表達，溫和灸組CGRP主要表達在真皮層結締組織；對照組皮膚組織中可見SP表達，溫和灸組SP主要表達在毛囊；對照組皮膚組織中可見VIP表達，溫和灸組VIP主要表達在真皮層結締組織，表皮層也有表達，見圖2-4。

圖2　后三里穴局部皮膚CGRP表達結果（免疫組化，×100）

圖3　后三里穴局部皮膚SP表達結果（免疫組化，×100）

圖4　后三里穴局部皮膚VIP表達結果（免疫組化，×100）

3　討論

在艾灸治療的過程中，溫度是重要的生物物理因素之一［4-6］。艾灸燃燒時產生的熱量通過腧穴局部傳入體內，溫通效應不僅涉及到表皮，還影響到皮下和肌層。我們的實驗結果提示，溫和灸的熱刺激對施灸局部的溫通效應體現(xiàn)在改變了施灸穴位局部皮膚的形態(tài)結構，同時影響了皮膚組織內的CGRP、SP、VIP等生物活性物質的分泌和表達，這對于研究針灸刺激體表啟動靶器官效應的獨特機制有重要意義?；谄つw的神經(jīng)-免疫-內分泌的相關生物學新知識［7-10］，為研究艾灸以溫促通作用機制的生物學基礎提供了啟示。艾灸的溫通作用可以引發(fā)局部的神經(jīng)源性炎癥，而神經(jīng)源性炎癥發(fā)病過程中的重要介質包括興奮性神經(jīng)遞質如速激肽（如P物質、神經(jīng)激肽A）、降鈣素基因相關肽（CGRP）及抑制性神經(jīng)遞質為VIP、一氧化氮（NO）等。有報道［11］指出SP是神經(jīng)源性炎癥的生物標志物，是觸發(fā)神經(jīng)源性炎癥的重要物質。SP具有傳遞皮膚感覺信息、擴張血管、促進細胞增殖、誘發(fā)局部炎性作用及影響免疫系統(tǒng)等功能。SP激發(fā)瀑布式炎癥反應，最終可能使局部炎癥通過神經(jīng)機制的介導而擴展［12］。肥大細胞自身能分泌SP，釋放出的SP，又可促使肥大細胞進一步釋放出大量的炎癥介質，形成正反饋調節(jié)，擴大炎癥反應。CGRP的外周生物學作用廣泛，是已知最強烈的血管舒張劑。CGRP可抑制SP酶的降解過程，同時也促進SP從初級傳入纖維末梢的釋放。所以，CGRP可通過增強SP的生物學效應，促進炎癥反應的發(fā)生。在皮膚，VIP能直接影響血管功能的調節(jié)，介導血管舒張和擴散，同時能引起在傷口愈合中起重要作用的膠質形成細胞。VIP可以通過從肥大細胞釋放的組胺和緩激肽誘導的水腫來參加神經(jīng)源性炎癥。肥大細胞是神經(jīng)內分泌肽的重要靶細胞，在某些組織中，肽能神經(jīng)纖維和肥大細胞在解剖學上緊密相連。刺激神經(jīng)纖維，可以經(jīng)肥大細胞介導放大炎癥反應。多種神經(jīng)內分泌肽，如SP、VIP均能與其受體結合，活化肥大細胞，引起肥大細胞的脫顆粒及組胺的釋放。艾灸引發(fā)局部的神經(jīng)源性炎癥，對皮膚神經(jīng)肽、肥大細胞以及與瞬時感受器電位（TRP）家族的影響，可能是艾灸以溫促通作用機制的生物學基礎，值得進一步深入研究。

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Effects of Mild Moxibustion on the Local Morphology of HouSanLi Points and the Expressions of CGRP，SP and VIP in Rats

LI Mei，WANG Yaoshuai△，WANG Yingyue
The Second Clinical School of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China

Objective：To study the warming effects of the mild moxibustion on HouSanLi points of the rats and its biological basis.Methods：HouSanLi points of the hyperlipidemia rat models were observed.HE staining and immunohistochemical methods were adopted to observe the local skin morphological structure of HouSanLi points，expression changes of calcitonin gene-related peptide（CGRP），substance P（SP）and vasoactive intestinal polypeptide（VIP）in skin tissues under the stimulating of the mild moxibustion.Results：when mild moxibustion group was compared with the control group，local skin morphological structure of HouSanLi points changed obviously，cutinized layer became thin or disappeared，the epidermis layer was not complete and dermis collagen fibers were in loose arrangement；the expression of CGRP in acupoint local skin appeared in dermal connective tissue more after the moxibustion，SP more expressed in hair follicles and VIP expression in the dermis of connective tissue and epidermis.Conclusions：Heat stimulating of the mild moxibustion can change the local morphological structure of Hou－SanLi points and affect the expressions of CGRP，SP and VIP in the local skin of HouSanLi points.And the effects above may be related to the biological basis of the warming effect of moxibustion.

mild moxibustion；HouSanLi；CGRP；SP；VIP

R285.5

A

1004-6852（2016）06-0007-03

2015-12-23

南京中醫(yī)藥大學自然科學基金預研項目（編號13XYYZ6）。

李梅（1987—），女，碩士學位。研究方向：針灸治療神經(jīng)內分泌疾病的效應研究。

△王耀帥（1983—），男，博士學位，講師。研究方向：針灸治療神經(jīng)內分泌疾病的效應研究。