梁金環(huán)，趙利娜，崔云鵬滄州醫(yī)學高等?？茖W校，河北滄州061001

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養(yǎng)陰活血方藥對糖尿病大鼠腎皮質(zhì)氧化應激損傷的保護作用

梁金環(huán)，趙利娜，崔云鵬
滄州醫(yī)學高等?？茖W校，河北滄州061001

目的：通過觀察養(yǎng)陰活血方藥對糖尿?。―M）大鼠腎皮質(zhì)一氧化氮合酶（NOS）及過氧亞硝基（ONOO-）水平的影響，探討?zhàn)B陰活血方藥對糖尿病大鼠腎皮質(zhì)氧化應激損傷的保護作用。方法：將16只SD大鼠采用鏈脲佐菌素（STZ）復制糖尿病大鼠模型造模，造模成功后，隨機分為糖尿病對照組（DM組，n=8）和養(yǎng)陰活血方藥組（NYPBR組，n=8），另設(shè)8只健康SD大鼠為正常對照組（NC組）。NYPBR組給予養(yǎng)陰活血方藥干預。至10周末，檢測各組大鼠腎皮質(zhì)丙二醛（MDA）含量及超氧化物岐化酶（SOD）、總NOS（TNOS）、誘導型NOS（iNOS）和固有型NOS（cNOS）的活性，免疫組化檢測腎皮質(zhì)ONOO-特異性標志物硝基酪氨酸（NT）的生成，檢測各組大鼠血糖、體質(zhì)量、腎質(zhì)量、24小時尿蛋白及血肌酐。結(jié)果：與NC組相比，DM組大鼠腎皮質(zhì)MDA［（1.78±0.16）nmol/mgprot］水平升高（P＜0.05），SOD［（68.96±3.82）U/mgprot］活性下降，TNOS（3.44±0.30）U/mgprot與iNOS（2.54±0.21）U/mgprot活性顯著升高，NT［（42.66±3.14）］生成明顯增加，腎質(zhì)量/體質(zhì)量、24小時尿蛋白、血肌酐水平顯著升高。上述指標2組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。干預后，BYPBR組腎質(zhì)量/體質(zhì)量、24小時尿蛋白、血肌酐較DM組均有明顯改善，MDA［（1.56±0.08）nmol/mgprot］下降，SOD［（76.44±4.90）U/mgprot］升高，i-NOS［（2.54±0.21）U/mgprot］活性和NT（26.19±1.58）生成均顯著降低，上述指標組內(nèi)比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。cNOS 3組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論：NYPBR可顯著減輕糖尿病大鼠腎皮質(zhì)氧化應激損傷，此作用可能與提高SOD活性，降低iNOS活性及ONOO-的生成有關(guān)。

糖尿病腎?。谎趸瘧?；誘導型一氧化氮合酶；過氧亞硝基；養(yǎng)陰活血方藥

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病全身微血管病變的腎臟特征表現(xiàn)，是導致糖尿病患者慢性腎衰竭的最主要原因。DN的發(fā)病機制較為復雜，隨著對DN研究的不斷深入，氧化應激被認為是DN發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)［1］。ONOO-由超氧陰離子（O2-）氧化NO生成，是目前已知氧化性最強的一類物質(zhì)［2］。糖尿病高糖狀態(tài)下，異常生成的NO和ONOO-引發(fā)的氧化應激損傷可能參與糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展。中醫(yī)學認為消渴病以陰虛為本，并有消渴必瘀，瘀可致消的說法，以此病機為治則，筆者確立養(yǎng)陰活血方藥對糖尿病大鼠進行防治［1］，旨在探討?zhàn)B陰活血方藥對糖尿病大鼠腎皮質(zhì)氧化應激損傷的保護作用及其與NOS、ONOO-的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1材料鏈脲佐菌素（STZ Sigma公司生產(chǎn)，批號067K1403），肌酐、尿蛋白定量、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒及MDA、SOD和NOS（分型）測試盒均購自南京建成生物工程研究所，鼠抗鼠NT單克隆抗體（Cayman公司提供，批號125210），養(yǎng)陰活血方藥以六味地黃丸為基本方加減而成，包括熟地黃20 g，牡丹皮20 g，山藥15 g，山萸肉10 g等六味中藥，常規(guī)水煎成1 000 g/L生藥濃度藥液［1］。

1.2模型建立及分組健康雄性SD大鼠24只（河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證編號：809091），4月齡，體質(zhì)量250～300 g。16只大鼠腹腔注射STZ溶液制備糖尿病模型，注射后3天取尾靜脈血測血糖，血糖≥16.7 mmol/L，且能維持1周以上，確定糖尿病模型。成模大鼠隨機分為：糖尿病對照組（DM組，n=8只）和養(yǎng)陰活血方藥組（NYPBR組，n=8只）。同批次8只健康SD大鼠作為正常對照組（NC組），給予等體積檸檬酸鈉緩沖液注射。NYPBR組按人和動物間體表面積折算的等效劑量灌喂給藥（含生藥1 g/mg），每只大鼠3 mL/d。實驗期間所有大鼠均正常飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3樣本采集造模成功10周結(jié)束，收集各組大鼠24小時尿液，稱取體質(zhì)量，檢測血糖；股動脈放血，收集血標本，分離腎臟并稱質(zhì)量，計算腎肥大指數(shù)；取部分腎皮質(zhì)4%多聚甲醛溶液中固定，用于免疫組織化學檢測；其余腎皮質(zhì)液氮保存。

1.4實驗檢測取尾靜脈血，檢測成模及10周末時的血糖變化。按試劑盒操作說明測定血肌酐、24小時尿蛋白。取腎皮質(zhì)，稱質(zhì)量，用預冷生理鹽水制備10%的組織勻漿，低溫離心，取上清液；測定勻漿液MDA、SOD、TNOS、誘導型NOS（iNOS）及組成型NOS（cNOS），考馬斯亮藍法測定組織蛋白含量，均嚴格按照試劑盒說明書操作。采用免疫組織化學法檢測NT的生成：石蠟切片常規(guī)脫蠟，3%H2O2處理，滴加鼠抗鼠NT單克隆抗體，滴加二抗（羊抗鼠），再滴加HRP標記的鏈霉卵白素工作液，聯(lián)苯胺（DAB）顯色，脫水封片，顯微鏡下觀察，并分析NT表達相對強度。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)采用（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1一般情況10周病程結(jié)束時，與NC組比較，DM組大鼠血糖顯著升高，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），腎臟肥大指數(shù)增大，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Scr和24小時尿蛋白均顯著增高，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DM組相比，NYPBR組血糖較低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Scr和24小時尿蛋白定量均顯著降低（P＜0.05），腎臟肥大指數(shù)無明顯變化（P＞0.05）。見表1。

表1　各組大鼠血糖、腎重/體質(zhì)量、24 h尿蛋白及血肌酐的變化s）

表1　各組大鼠血糖、腎重/體質(zhì)量、24 h尿蛋白及血肌酐的變化s）

注：與NC組比較，**表示P＜0.01；與DM組比較，▲▲表示P＜0.01。

組別只數(shù)血糖/（mmol·L-1）腎重/體質(zhì)量（×10-3）24小時尿蛋白/mgScr/（μmol·L-1）NC DM NYPBR 888 5.26±0.43 26.38±1.11**25.42±0.79 2.91±0.13 5.70±0.29**5.33±0.33 7.68±0.551 148.91±14.84**79.19±8.40▲▲22.78±9.76 261.68±34.37**197.22±19.02▲▲

2.2腎皮質(zhì)M D A、SO D與NC組比較，DM組MDA水平升高，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），SOD活性顯著降低，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DM組相比，NYPBR組MDA水平下降（P＜0.05），SOD活性升高，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2　各組大鼠腎皮質(zhì)M D A、SO D的變化（χ±s）

表2　各組大鼠腎皮質(zhì)M D A、SO D的變化（χ±s）

注：與NC組比較，**表示P＜0.01；與DM組比較，▲表示P＜0.05。

2.3腎皮質(zhì)TN O S、i N O S、及cN O S與NC組比較，DM組TNOS、iNOS活性均顯著升高，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；cNOS活性高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與DM組相比，NYPBR組TNOS、iNOS活性均顯著降低，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），cNOS活性無明顯變化，2組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.4腎皮質(zhì)N T免疫組化NC組染色呈灰藍色，未檢出NT生成，DM組NT免疫組化染色呈黃褐色，陽性信號主要定位于腎小球，NYPBR組染色強度弱于DM組，NT生成量顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3　各組大鼠腎皮質(zhì)TNOS、iNOS、cNOS活性及NT含量變化

3　討論

隨著糖尿病發(fā)病率逐年提高，DN已成為導致慢性腎功能衰竭的主要原因［2］。多種復雜機制介導了DN的發(fā)生，氧化應激被認為是重要的共同機制。活性氧簇（ROS）中ONOO-及其衍生物氧化能力較H2O2強約2 000倍，是氧化性最強的一類，構(gòu)成了氧化應激新的物質(zhì)基礎(chǔ)。

大量實驗顯示，DM早期NO合成和活性增加，隨著DM的進展，NO生物學活性降低［3］。但有研究表明NO的合成量并沒有減少［4］。在實驗中，DM組大鼠腎皮質(zhì)脂質(zhì)過氧化標志物-MDA含量升高，清除O2-的SOD活性下降，TNOS顯著增強，表明糖尿病大鼠腎皮質(zhì)處于明顯的氧化應激狀態(tài)。隨著TNOS的升高，iNOS升高顯著，但cNOS變化不明顯，表明TNOS活性增強主要是由iNOS活性升高引起。

本實驗NT免疫組化檢測結(jié)果顯示，DM組大鼠腎實質(zhì)NT染色強度最大，主要分布在腎小球，腎小管也見染色，各組大鼠NT的生成量與其iNOS活性變化及腎功能紊亂狀態(tài)相平行，表明ONOO-引發(fā)的氧化應激損傷在DN的發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用［5］。

糖尿病腎病屬中醫(yī)“消渴”病之“下消”范疇，其病機主要在于腎陰虧虛，腎失固攝，病程日久，陰損及陽，可致陰陽俱虛，腎氣衰敗，五臟損極，濁毒壅塞三焦，升降失常，而成危候，最終出現(xiàn)病名為糖尿病腎病的一系列病理變化。本研究藥物六味地黃丸三陰并補而重在補腎陰之意，六藥并用，共收養(yǎng)陰活血之功。本實驗中，NYPBR組大鼠腎皮質(zhì)MDA水平下降，iNOS活性及NT生成量明顯降低，而SOD活性升高，尿蛋白、血肌酐降低，表明NYPBR增強了機體的抗氧化能力，對腎功能紊亂有不同程度的改善。

綜上所述，DM大鼠模型建立10周后，腎皮質(zhì)iNOS活性增強，NT生成增加，與腎功能改變相一致，表明iNOS過度激活導致腎皮質(zhì)ONOO-大量生成引發(fā)的細胞毒性作用可能是造成DM腎臟損傷的重要機制之一。NYPBR可能是通過抑制iNOS的活性、提高SOD水平，進而降低ONOO-造成的氧化應激損傷，延緩或減輕DN的病理進程。目前已有單味山萸肉、熟地黃等應用于DN治療的實驗研究［6-7］，但具體機制，尚有待進一步研究。

［1］齊錦生，李恩，薛智權(quán)，等.滋陰補腎方藥對糖尿病大鼠骨中一氧化氮合酶mRNA表達的影響［J］.中醫(yī)雜志，2003，44（5）：379-381.

［2］謝席勝，艾娜，王寶福，等.糖尿病腎病流行病學研究進展［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2013，14（10）：937-939.

［3］金智生，陳雪，李甜.金匱腎氣丸對實驗性2型糖尿病腎病大鼠腎臟組織NO、NOS的影響［J］.中醫(yī)藥學報，2012，40（1）：56-59.

［4］潘振宇.氨基胍對糖尿病大鼠腎損害的治療作用［J］.中國實用醫(yī)藥，2009，4（6）：4-6.

［5］廖琳，陳青，李國安，等.一氧化氮和一氧化氮合酶基因多態(tài)性與糖尿病腎病［J］.國外醫(yī)學內(nèi)科學分冊，2005，32（10）：436-439.

［6］史云菊，張紅艷，張德甫，等.山茱萸對2型糖尿病患者血糖和體質(zhì)量的影響［J］.中醫(yī)研究，2014，27（8）：23-24.

［7］吳金環(huán)，顧紅巖，喇孝瑾，等.地黃與熟地黃對糖尿病小鼠血糖血脂的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2014，17（8）：161-163.

Protection of Nourishing Yin and Promoting Blood Circulation Recipe on the Oxidative Stress Injuries in Renal Cortex of Diabetic Rats

LIANG Jinhuan，ZHAO Li'na，CUI Yunpeng
Cangzhou Medical College，Cangzhou 061001，China

Objective：To investigate the protection of nourishing Yin and promoting blood circulation recipe（NYPBR）on the oxidative stress injuries in renal cortex of diabetic rats through observing the effect of nourishing Yin and promoting blood circulation recipe on the level of nitric oxide synthase（NOS）and peroxynitrite（ONOO-）in renal cortex of diabetic rats.Methods：Sixteen SD rat models were replicated by streptozotocin（STZ）and divided into diabetes control group（DM group，n=8），nourishing Yin and promoting blood circulation recipe group（NYPBR group，n=8）and normal control group（NC group）with eight healthy rats at random.The NYPBR group was treated with NYPBR.By the end of the tenth week，the content of renal cortices malondiadehyde（MDA），the activity of superoxide dismutase（SOD），total NOS（TNOS），inducible NOS（iNOS）and constitutive NOS（cNOS）were measured，the generation of nitrotyrosine（NT）as the specific marker of renal cortex ONOO-was detected by immunohistochemical method，blood sugar，body weight，kidney weight，24-hour urine protein and serum creatinine（SCr）were determined in three groups.Results：Compared with NC group，renal cortex MDA［（1.78±0.16）nmol/mgprot］of DM group elevated（P＜0.05），the activity of SOD［（68.96±3.82）U/mgprot］decreased（P＜0.05），the activities of TNOS（3.44±0.30）U/mgprot and iNOS（2.54±0.21）U/mgprot elevated significantly（all P＜0.05），the generation of NT［（42.66±3.14）］increased greatly（P＜0.05），the level of renal mass/body mass，24-hour urine protein and SCr rose greatly（P＜0.05）. After the intervention，renal mass/body mass，24-hour urine protein and SCr improved significantly（P＜0.05），MDA［（1.56±0.08）nmol/mgprot］lowered（P＜0.05），SOD［（76.44±4.90）U/mgprot］elevated（P＜0.05），the activity of iNOS［（2.54±0.21）U/mgprot］and the generation of NT（26.19±1.58）descended greatly（all P＜0.01）.The differences between cNOS（0.70±0.12）U/mgprot and cNOS（0.74±0.13）U/mgprot）of DM group had no statistical significance（P＞0.05）.Conclusion：NYPBR could significantly relieve renal cortex injuries of diabetes rat，which might be related to improving SOD activity，and decreasing iNOS activity and the generation of ONOO-.

diabetic nephropathy；oxidative stress；inducible NOS；peroxynitrite；nourishing Yin and promoting blood circulation recipe

R285.5

A

1004-6852（2016）06-0010-03

2015-12-02

梁金環(huán)（1970—），女，碩士學位，副教授。研究方向：糖尿病及其并發(fā)癥的診治。