張坤 綜述 王紅 審校

50%以上的真核生物蛋白存在翻譯后糖基化修飾，影響蛋白質(zhì)折疊、穩(wěn)定、運輸、分泌以及生物功能[1-3]。在哺乳動物寡糖合成系統(tǒng)中，巖藻糖是十種單糖之一，巖藻糖基化是糖蛋白、糖脂寡糖修飾中最常見的修飾方式；已知的巖藻糖修飾有ABO血型系統(tǒng)的H抗原、Lewis血型抗原；巖藻糖還參與選擇素介導的白細胞外滲或淋巴細胞歸巢、病原宿主相互作用、信號轉導通路的修飾；在多種病理情況下（如免疫、腫瘤），存在巖藻糖基化水平異常[4]。白細胞粘附缺陷II患者巖藻糖基化異常導致白細胞與內(nèi)皮細胞粘附缺陷[5]。Baumann等[6]于1979年首次報道了肝癌細胞中的巖藻糖基化的存在。AFP-L3，巖藻糖基化的甲胎蛋白（α-fetoprotein, AFP），AFP三種亞型之一，在日本（1996年）和美國（2005年）批準作為肝細胞肝癌的腫瘤標志物[7,8]。隨著蛋白質(zhì)組學以及糖生物學研究手段的進步，腫瘤中越來越多的異常巖藻糖基化被發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤細胞生長、侵襲、轉移、免疫逃逸以及治療抵抗方面發(fā)揮重要作用。

1 腫瘤中異常巖藻糖基化

1.1 生理條件下巖藻糖基化過程 巖藻糖基化是典型的末端修飾方式。包括N聚糖、粘蛋白型O糖以及直接與蛋白質(zhì)絲/蘇氨酸殘基羥基上相連的巖藻糖[4]。GDP巖藻糖是巖藻糖基化的唯一供體，其在細胞質(zhì)中合成，而后通過GDP巖藻糖轉運體（GDP-L-fucose transporter, GDPL-Fuc Tr）進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體[9,10]。哺乳動物可通過兩種途徑合成GDP巖藻糖。從頭合成途徑：通過3步反應將GDP甘露糖轉化為GDP巖藻糖，催化反應的酶為GDP甘露糖-4,6-脫水酶（GDP-mannose-4,6-dehydratase,GMDS）[11,12]和GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖-3,5異構酶-4-還原酶（GDP-4-keto-6-deoxymannose-3,5-epimerase-4-reductase,FX）[13]；補救合成途徑：通過兩步反應將L-巖藻糖轉化為GDP巖藻糖，催化反應的酶為L-巖藻糖激酶[14]和GDP巖藻糖焦磷酸酶[15]。哺乳動物細胞僅有中10%GDP巖藻糖由補救合成途徑合成，因此從頭合成途徑在GDP巖藻糖合成中起關鍵作用[4]。

細胞中所有的巖藻糖基化都是由巖藻糖基轉移酶（fucosyltransferases, FUT）催化。目前已知的人類巖藻糖基化轉移酶有13個[4]。蛋白氧巖藻糖基轉移酶1、2（protein O-fucosyltransferase, POFUT）定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，其余定位于高爾基體[4,16,17]。FUT根據(jù)功能不同可分為四組，F(xiàn)ut1、Fut2參與α1-2巖藻糖合成，F(xiàn)ut3-7、Fut9-11參與α1-3巖藻糖合成，F(xiàn)ut3、5參與α1-4巖藻糖合成，F(xiàn)ut8參與α1-6巖藻糖合成。Fut1-7、Fut9-11參與末端巖藻糖基化修飾，將巖藻糖基與N-糖或O-糖的末端糖基相連；Fut8參與核心巖藻糖基化修飾，將巖藻糖基與N-糖最內(nèi)端的N乙酰葡萄糖相連[18,19]（圖1）。

1.2 腫瘤中異常巖藻糖基化及其調(diào)節(jié) 肺癌、結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌等多種腫瘤中均存在巖藻糖基化異常[20,21]。GDP巖藻糖合成酶、巖藻糖轉運體、巖藻糖基轉移酶參與其中，其與腫瘤的分期、預后等密切相關。各種酶在不同腫瘤中的表達情況存在差異；同一種酶在腫瘤的不同病理類型以及不同階段表達情況也不完全相同。

1.2.1 腫瘤中GDP巖藻糖合成、轉運異常 結直腸腫瘤細胞系[22]、肝細胞肝癌組織[23]中存在FX高表達。與原位結直腸腫瘤細胞系sw480相比，轉移性腫瘤細胞系sw620中高表達FX，其與細胞SLea的表達成正相關，并可增強腫瘤-內(nèi)皮細胞粘附[22]。Moriwaki等[24]在結腸癌細胞系HCT116中發(fā)現(xiàn)GMDS外顯子5、6、7缺失從而導致酶活性喪失，細胞巖藻糖基化缺失。同時該研究組在胃絨毛膜癌患者網(wǎng)膜轉移組織中也發(fā)現(xiàn)了GMDS突變（外顯子2、3、4缺失）。在肝細胞癌[23]及結直腸腫瘤組織[25]中存在GDP-L-Fuc Tr高表達。Moriwaki[23]的結果表明，GDP-L-Fuc Tr在肝癌細胞巖藻糖基化中發(fā)揮關鍵性作用。

1.2.2 腫瘤中巖藻糖基化修飾異常

1.2.2.1 核心巖藻糖基化異常 Fut8參與核心巖藻糖基化修飾。肺癌[26]、乳腺癌[27]、肝癌[28]、結直腸癌[29]、卵巢癌[30]、甲狀腺癌[31]等腫瘤組織中存在Fut8高表達，在胃癌[32]組織中Fut8表達下降，這種組織差異性的具體原因目前還不清楚，可能在不同組織中蛋白核心巖藻糖基化的功能不同。

1.2.2.2 末端巖藻糖基化異常 Fut1-7、Fut9-11均參與末端巖藻糖基化修飾，形成特異的lewis血型抗原，如I型lewis抗原表位Lea、sLea、Leb和II型lewis抗原表位Lex、sLex、Ley。其中的α1-2巖藻糖基化由Fut1、Fut2催化，α1-3巖藻糖基化由Fut3-7、Fut9催化，α1-4巖藻糖化由Fut3催化[27]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中存在Ley、sLex、sLea，三者在不同病理類型中表達存在很大差異，在腺癌中的表達最高，鱗癌和大細胞癌次之，與不表達者相比，表達者具有相對短的生存期[33]，乳腺癌中表達Lex、sLex、Ley，高表達sLex、Ley與淋巴結轉移、不良預后相關[34-36]。結直腸癌中Lea、sLea、Lex、sLex，表達Lex、sLex的患者具有較短的生存期[37]。卵巢癌中表達Lea、sLea、Ley，不同病理類型中存在較大差異，粘液性腫瘤中表達Lea、sLea，而漿液性腫瘤中主要表達Ley[38]。這些結果表明，末端巖藻糖基化與腫瘤患者預后密切相關；在不同腫瘤組織、同一腫瘤不同病理類型中，末端巖藻糖基化存在較大差異。

圖 1 生理條件下巖藻糖基化過程。GDP巖藻糖通過從頭合成途徑及補救合成途徑在胞質(zhì)內(nèi)進行合成，然后通過GDP巖藻糖轉運體進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者高爾基體，最終在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（POFUT1、2）及高爾基體（FUT1-11）中將巖藻糖轉移到受體上。Fig 1 Fucosylation pathways.GDP-fucose is synthesized in the cytoplasm from GDP-mannose (de novo pathway) or L-fucose(salvage pathway).In case it is compounded,GDP-fucose is transported into the ER/Golgi through GDP-fucose transporters.Fucose is transferred from GDP-fucose to acceptors in ER (POFUT1, 2) or Golgi (FUT1-11).

2 巖藻糖基化與腫瘤增殖、侵襲、轉移

腫瘤的增殖、侵襲、轉移是復雜的級聯(lián)反應過程，包括原位腫瘤的增殖，向基底膜、血管侵襲移動，穿入血管，與特定靶器官處血管內(nèi)皮粘附、穿出，最終在靶器官定植、增殖[39]。巖藻糖基化均參與了這一過程。

Ley存在于多種腫瘤組織中，與腫瘤增殖相關，其α1-3巖藻糖基化由Fut4催化[40-41]，人表皮鱗癌細胞系A431中過表達Fut4后，其增殖能力增加，S期細胞所占比例提高，進一步研究表明，F(xiàn)ut4過表達通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）以及磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B, PKB/Akt）通路，增加周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent protein kinases, CDKs）及細胞周期蛋白（cyclins）表達，降低CDK抑制劑P21、P27表達[42]。

整合素家族與細胞生長、增殖、凋亡抵抗和惡性轉化密切相關，α3β1整合素參與腫瘤侵襲、轉移[43,44]。Fut8敲除的鼠胚胎纖維母細胞α3β1整合素核心巖藻糖基化缺失，導致下游的FAK磷酸化水平降低，細胞侵襲、移動能力下降[45]。

表皮-間質(zhì)轉化是腫瘤侵襲、轉移的重要起始[39]，在此過程中，表皮細胞丟失細胞-細胞粘附特性，增加運動功能及侵襲能力。轉化生長因子β（transforming growth factor β, TGF-β）是不同細胞表皮-間質(zhì)轉化的主要誘導因子，介導腫瘤的侵襲轉移，結直腸癌細胞系中敲除Fut3和/或Fut6，抑制TGF-β誘導的表皮-間質(zhì)轉化，抑制細胞侵襲能力[46]。乳腺癌細胞系中敲除Fut4，表皮標志物E-cadherin表達增加，間質(zhì)標志物纖連蛋白、波形蛋白、N-cadherin、Snail、Twist、ZEB1表達下降，PI3K/Akt-糖原合成酶激酶（glycogen synthase kinases-3β, GSK3β）信號通路及細胞核因子酉乙蛋白（nuclear factor kappa B, NF-κB）信號通路參與其中[47]。

選擇素與腫瘤細胞表面sLea、sLex相互作用，促進腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞的粘附，從而促進腫瘤細胞穿出血管[48,49]。過表達FX促進結腸癌細胞與內(nèi)皮細胞的粘附，而敲除FX降低其與內(nèi)皮細胞的粘附[22]。表達Fut7肺腺癌細胞系A125能夠在血管內(nèi)皮細胞上滾動，而缺乏Fut7轉染肺腺癌細胞系A125卻不能[50]。造血系統(tǒng)細胞HL60，KG1a表達Fut4、7，結腸腫瘤細胞colo205表達Fut3、4、6，前列腺癌細胞MDA PCa2b表達Fut3，F(xiàn)ut3敲除抑制了循環(huán)腫瘤細胞在血管內(nèi)皮細胞上的滾動，而不影響血液系統(tǒng)細胞與內(nèi)皮細胞的粘附[51]，可作為腫瘤治療的策略之一。

3 巖藻糖基化異常與腫瘤免疫逃逸

Moriwaki等[24]發(fā)現(xiàn)結腸癌細胞系HCT-116細胞GMDS突變，導致細胞巖藻糖基化水平下降，與腫瘤形成、發(fā)展、轉移密切相關。體外和體內(nèi)實驗表明，GMDS突變HCT-116細胞能夠逃避自然殺傷（natural killer, NK）細胞介導的免疫監(jiān)視，抵抗腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL）誘導的細胞凋亡。同時，HCT-116細胞對CD95L的刺激也產(chǎn)生抵抗，其可能原因是GMDS突變抑制了Fas相關死亡結構域（Fasaasociated death domain, FADD）依賴的復合物II中Caspase 8的激活[52]。人白血病細胞K562中轉染Fut7后，NK細胞對高表達sLex細胞的殺傷效能是野生型K562細胞的2.5倍，表明細胞表面sLex的存在促進NK細胞的殺傷活性，而腫瘤細胞因低表達sLex從而逃避NK細胞的殺傷[53]。

4 巖藻糖基化與表皮生長因子受體

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）是細胞膜表面的糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。EGFR具有潛在的12個N糖基化位點[54]，N糖基化抑制劑明顯降低EGF與EGFR的結合[55]，A431肺腺癌細胞系中10個位點存在糖基化，其中7個位點存在巖藻糖基化修飾[56]。卵巢癌RMG-I細胞系中轉染α1-2巖藻糖轉移酶后，細胞增殖能力增強，其通過EGFR發(fā)揮作用，Akt、ERK1/2參與其中[57]。FUT8敲除的小鼠胚胎纖維母細胞，EGFR巖藻糖基化及磷酸化水平明顯下降，其下游信號分子JNK、ERK1/2磷酸化水平也受到抑制，同時親合力測試發(fā)現(xiàn)，核心巖藻糖基化的EGFR與EGF的親和力更高[58]，因此，巖藻糖基轉移酶通過對EGFR的活性產(chǎn)生影響，從而導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

5 巖藻糖基化與肺癌

復旦大學的研究[59]顯示，13例轉移性肺癌患者中12例存在E-cadherin核心巖藻糖基化，而5例原位組織中E-cadherin均無核心巖藻糖基化，說明E-cadherin核心巖藻糖基化參與腫瘤的轉移，進一步研究表明核心巖藻糖基化可能破壞了E-cadherin N糖的三維結構，從而影響其功能。

臺灣大學的研究[60]表明，肺腺癌細胞系CL1-5與CL1-0相比具有高侵襲能力，同時CL1-5具有更高的巖藻糖基化，其Fut8表達是CL1-0的22.5倍，說明巖藻糖基化與腫瘤的侵襲力相關。同時，肺癌細胞系A549中過表達Fut4/6導致EGFR二聚化、磷酸化水平下降，而CL1-0及A549細胞系中過表達Fut8對EGFR活性卻無影響，CL1-5細胞系中敲除Fut8后EGFR二聚化、磷酸化下降，提示過表達Fut4/6抑制了肺癌細胞中EGFR二聚化、磷酸化，同時表明FUT8在維持肺癌細胞EGFR二聚化、磷酸化中起關鍵作用。其后的研究中，該課題組[26]發(fā)現(xiàn)，140例I期-IV期的NSCLC患者（86例肺腺癌，46例肺鱗癌及8例肺大細胞癌）中均存在Fut8表達，在肺腺癌中Fut8表達水平最高，F(xiàn)ut8表達水平與轉移復發(fā)相關，并且Fut8高表達者具有更短的無病生存期和總生存期，同時體外研究表明，過表達Fut8增加肺癌細胞系的增殖侵襲和轉移能力。其后，日本北海道大學和大阪大學的研究人員[61]發(fā)現(xiàn)，在I期及可治愈的外科切除的129例NSCLC患者中，高表達Fut8與不良預后相關。這些結果表明，核心巖藻糖基化與肺癌增殖、侵襲、轉移以及疾病預后密切相關。靶向腫瘤中Fut8可能成為治療肺癌的新策略。

另外，在含表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）的培養(yǎng)條件下，沉默A549細胞中Fut8后，EGFR及MAPK磷酸化水平下降，其對吉非替尼的敏感性明顯下降，表明Fut8下調(diào)可降低野生型EGFR對酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）的敏感性[62]。同時這也可能是野生型EGFR高表達患者對吉非替尼有效的原因，其是否可以作為野生型患者EGFR-TKI療效的預測因子有待進一步研究。

然而，其他巖藻糖基轉移酶及GDP巖藻糖合成酶（GMDS和FX）在肺癌中的表達及在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用目前還未知。

6 總結

腫瘤細胞巖藻糖基化異常參與細胞表面受體EGFR、TGF-βR的激活，影響整合素、選擇素、凋亡信號通路的功能，并最終參與腫瘤增殖、凋亡、侵襲、轉移及藥物敏感性。大多數(shù)腫瘤中都存在巖藻糖基化異常，因此針對巖藻糖基化異常治療腫瘤將成為可能。然而，在不同腫瘤類型、同一腫瘤不同病理類型以及同一腫瘤的不同發(fā)展階段，其巖藻糖基化都有可能不同。其次，在不同腫瘤類型中，巖藻糖基化過程中酶的作用也可能不同，結直腸細胞系sw620中高表達FX可能增加了腫瘤細胞的轉移能力，HCT116細胞中GMDS功能缺失促進了腫瘤細胞的免疫逃逸。這給腫瘤中巖藻糖基化的研究帶來了挑戰(zhàn)。目前，對巖藻糖基化的研究還處于基礎階段，我們的首要工作是弄清各種酶在不同腫瘤中的作用及其機制。相信，巖藻糖基化的研究會有一個美好的前景，針對腫瘤中異常巖藻糖基化的治療會給腫瘤患者帶來曙光。