柳斌 劉曉琴 楊業(yè) 葛俊 李靜

肺癌為一種惡性程度較高的腫瘤性疾病，其病死率居各種惡性腫瘤之首，發(fā)病率逐年上升[1]。小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）是支氣管肺癌中未分化癌分型，約占全部肺癌的15%。由于較早發(fā)生較強(qiáng)的侵襲性和早期發(fā)生血行及淋巴轉(zhuǎn)移，大多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，中位生存期不足1年，5年生存率不足5%[2]。SCLC的治療主要以化療為主。雖然SCLC患者早期對(duì)一線化療方案（足量EP方案：依托泊式或伊立替康+順鉑/卡鉑）敏感，但由于極易出現(xiàn)多藥耐藥（multidrug resistance, MDR）現(xiàn)象而導(dǎo)致治療失敗。因此，尋找有效的早期診斷及療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物是臨床亟待解決的難題。

隨著非編碼RNA（noncoding RNA, ncRNA）研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)ncRNA（主要包括microRNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA等）在腫瘤的的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、凋亡中起著重要的作用，雖然基因組分析發(fā)現(xiàn)了大量的LncRNAs，但目前只有少部分LncRNAs被廣泛用于研究，這些LncRNAs具有作為腫瘤診斷、預(yù)后分子標(biāo)志物的潛力，其表達(dá)水平與多種腫瘤的臨床病理特征以及預(yù)后相關(guān)[3-5]。研究其在SCLC發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)性將為SCLC的早期診斷及治療提供新突破。課題組前期通過LncRNA芯片發(fā)現(xiàn)LncRNA AK09398在SCLC耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)較敏感細(xì)胞株明顯增高，提示LncRNA AK09398可能與SCLC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本研究通過qRT-PCR方法檢測(cè)LncRNA AK09398在SCLC患者肺癌組織及其對(duì)應(yīng)的正常肺組織標(biāo)本中的表達(dá)情況，并對(duì)患者的臨床病理特征進(jìn)行分析，揭示LncRNA AK09398在SCLC中的可能作用，并探討LncRNA AK09398在SCLC早期診斷及預(yù)后評(píng)估中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 118例SCLC患者化療前組織標(biāo)本均來源于2011年1月-2015年12月本院腫瘤科、胸外科及呼吸內(nèi)科行手術(shù)及穿刺活檢或支氣管鏡活檢的組織標(biāo)本，其中53例SCLC原發(fā)病灶及癌旁組織（癌旁組織距離癌組織達(dá)5 cm以上），65例患者癌組織取自支氣管鏡或計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomopraphy, CT）引導(dǎo)下穿刺活檢標(biāo)本，65例非肺癌患者的正常肺組織取自各種原因?qū)е碌姆瓮鈧幕颊?，所有患者病例資料完整，術(shù)前均未行放化療。男性55例，女性63例，年齡30歲-83歲，平均年齡為（56±7.7）歲，體能狀態(tài)（performance status, PS）評(píng)分根據(jù)病程記錄和入院記錄進(jìn)行評(píng)價(jià)，統(tǒng)一采用美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組（Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，PS 0分-1分患者70例，PS≥2分48例，吸煙患者79例，有惡性腫瘤家族史24例，局限期50例，廣泛期68例。所有病例均經(jīng)過病理學(xué)檢查確診為SCLC，均接受EP（依托泊苷+順鉑/卡鉑）方案化療及全腦預(yù)防性放療，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。隨訪：全部118例患者出院后均隨訪，隨訪方式為電話隨訪和門診隨訪，隨訪內(nèi)容包括一般情況、臨床癥狀及影像學(xué)檢查。隨訪起點(diǎn)為手術(shù)或病理活檢日期，末次隨訪時(shí)間為2016年6月30日，至隨訪截止日，存活病例49例，死亡病例69例，無失訪病例。

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR分析LncRNA AK09398的表達(dá)水平 采用Trizol（Invitrogen, Grand Island, NY）方法提取組織標(biāo)本中總RNA。將提取的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，在20 μL體系中加2 μg總RNA進(jìn)行cDNA的合成。Real-time PCR采用2×SYBR Green PCR Master Mix，取適量cDNA作為摸板，引物濃度0.4 mol/L，15 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)置3個(gè)平行樣，根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)合成相應(yīng)上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參照。PCR反應(yīng)在定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ=2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。LncRNA AK09398在癌組織、癌旁正常組織中的表達(dá)差異采用方差分析。LncRNA AK09398在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)及其與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系分析使用Chi-Square檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法分析LncRNA AK09398的表達(dá)與生存時(shí)間及預(yù)后的關(guān)系，應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）預(yù)后的因素，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA AK09398在SCLC組織標(biāo)本中的表達(dá) LncRNA AK09398在肺癌癌組織中的平均表達(dá)水平為（7.813±0.373），與癌旁組織（1.782±0.116）及正常肺組織（1.209±0.200）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=58.41,P＜0.001）（圖1）。

2.2 SCLC組織標(biāo)本中LncRNA AK09398的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 118例SCLC患者中男性55例，女性63例；年齡30歲-83歲，中位年齡56歲，＜56歲52例，≥56歲66例。廣泛期68例，局限期50例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者70例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者48例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移68例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移50例。截止研究工作完成，存活病例49例，死亡病例69例。根據(jù)LncRNA AK09398平均表達(dá)水平（7.183），將SCLC患者分為L(zhǎng)ncRNA AK09398高表達(dá)組66例及低表達(dá)組52例，分析LncRNA AK09398的表達(dá)與患者年齡、性別、疾病分期、化療敏感性、轉(zhuǎn)移及患者的生存期的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA AK09398的表達(dá)與患者的年齡、性別無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；與疾病分期、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、化療敏感性及生存狀態(tài)明顯相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（表1）。

2.3 LncRNA AK09398的表達(dá)與SCLC患者生存分析 采用Kaplan-Meier法估計(jì)LncRNA AK09398的表達(dá)與患者生存時(shí)間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)LncRNA AK09398的患者的中位無進(jìn)展生存時(shí)間（progression-free survival, PFS）為9.06個(gè)月，較低表達(dá)者（19.92個(gè)月）縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=49.260,P＜0.001）；低表達(dá)LncRNA AK09398患者的中位總生存時(shí)間（overall survival, OS）為32.50個(gè)月，較高表達(dá)者（22.71個(gè)月）明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.700,P=0.001）（圖2）。

2.4 預(yù)后影響因素分析 多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，LncRNA AK09398的表達(dá)、轉(zhuǎn)移及臨床分期是SCLC獨(dú)立的預(yù)后因素（表2）。

3 討論

SCLC是一種以生長(zhǎng)迅速、早期轉(zhuǎn)移、高度侵襲性為特點(diǎn)的肺癌類型，其發(fā)病率約占原發(fā)性肺癌的15%-20%[6]。由于SCLC腫瘤細(xì)胞倍增時(shí)間短，進(jìn)展快，常伴內(nèi)分泌異?；蝾惏┚C合征[7]；早期即發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，故SCLC的治療應(yīng)以全身化療為主，聯(lián)合放療和手術(shù)為主要治療手段[8,9]。SCLC的腫瘤細(xì)胞早期對(duì)化療和放療都非常敏感，但幾十年來多方案的臨床試驗(yàn)并沒能找到徹底治愈SCLC的有效方法，因此，尋找SCLC的早期診斷及預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物已成為目前臨床亟待解決的問題。

表 1 SCLC患者組織標(biāo)本中LncRNA AK09398的表達(dá)與病理特征的關(guān)系Tab 1 Relationship of LncRNA AK09398 expression with pathological characteristics of SCLC patients

圖 1 qRT-PCR法檢測(cè)LncRNA AK09398在非腫瘤組織及SCLC組織中的表達(dá)Fig 1 The expression of LncRNA AK09398 were measured in nontumor tissues and SCLC tissues by qRT-PCR

圖 2 LncRNA AK09398的表達(dá)與SCLC患者無進(jìn)展生存時(shí)間及總生存時(shí)間的關(guān)系。A：LncRNA AK09398的表達(dá)與SCLC患者無進(jìn)展生存時(shí)間的關(guān)系；B：LncRNA AK09398的表達(dá)與SCLC患者總生存時(shí)間的關(guān)系。Fig 2 The relationship of LncRNA AK09398 expression with progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) in SCLC patients.A: The relationship of LncRNA AK09398 expression with PFS in SCLC patients; B: The relationship of LncRNA AK09398 expression with OS in SCLC patients.

表 2 Cox多因素分析影響SCLC預(yù)后的獨(dú)立因素Tab 2 Independent prognosis factors of SCLC by Cox multivariate analysis

LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200 nt的ncRNA，其本身缺乏明顯的開放閱讀框，不參與蛋白質(zhì)編碼功能，一直被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄的“噪音”而未受重視。然而最近的研究[10]表明，具有相對(duì)較長(zhǎng)的核苷酸鏈，其分子內(nèi)部具有特定而又復(fù)雜的二級(jí)空間結(jié)構(gòu)，能提供與蛋白質(zhì)結(jié)合的多個(gè)位點(diǎn)，或與DNA、RNA之間通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則發(fā)生特異性、動(dòng)態(tài)性相互作用，形成由LncRNA參與的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[11]。LncRNA作為近年來新發(fā)現(xiàn)的一類調(diào)控型非編碼RNA成為腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA與腫瘤的形成、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過程相關(guān)，有望成為新的腫瘤標(biāo)志物和腫瘤治療的靶點(diǎn)，在腫瘤診斷和治療方面顯示出良好的臨床應(yīng)用前景。近年來的研究[12]發(fā)現(xiàn)LncRNA GAPLINC通過靶向作用于SNAI2促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲性。上調(diào)LncRNA NEAT1的表達(dá)，促進(jìn)膀胱癌的進(jìn)展[13]。LncRNA CRNDE的上調(diào)與結(jié)直腸癌預(yù)后差相關(guān)，其表達(dá)與IRX5 mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)[14]；MALAT1是第一個(gè)在肺癌中被研究的LncRNA，它可以作為早期肺腺癌中患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后標(biāo)記物[15]。HOTAIR在NSCLC樣本中高表達(dá)，HOTAIR高表達(dá)狀態(tài)與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分級(jí)相關(guān)，此外，HOTAIR高表達(dá)的患者預(yù)后相對(duì)較差[16]。CCAT2被發(fā)現(xiàn)在NSCLC組織中高表達(dá)，CCAT2的高表達(dá)水平與肺腺癌相關(guān)，提示CCAT2可能是一個(gè)肺腺癌特異的LncRNA[17]。GAS5在NSCLC組織中低表達(dá)，其表達(dá)水平與NSCLC的腫瘤大小及臨床分級(jí)相關(guān)。GAS6-AS1在NSCLC組織中低表達(dá)，其表達(dá)水平與NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分級(jí)有關(guān)，而且GAS6-AS1是NSCLC患者一個(gè)獨(dú)立預(yù)后標(biāo)記物[18]。然而關(guān)于LncRNA在SCLC中的功能研究，目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道很少。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA CCAT2促進(jìn)SCLC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，高表達(dá)LncRNA CCAT2的患者的預(yù)后差[19]。LncRNA HOTAIR通過調(diào)節(jié)HOXA1基因的甲基化影響SCLC的化療敏感性[20]。課題組前期通過LncRNA芯片發(fā)現(xiàn)LncRNA AK09398在SCLC耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)較敏感細(xì)胞株中明顯增高，提示LncRNA AK09398可能與SCLC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本研究通過比較118例臨床資料完整的SCLC組織及癌旁組織標(biāo)本中的LncRNA AK09398表達(dá)，分析其表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA AK09398在SCLC組織標(biāo)本中的表達(dá)較癌旁組織明顯增高。LncRNA AK09398的表達(dá)與患者的年齡、性別無關(guān)；與疾病分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、化療敏感性及生存狀態(tài)明顯相關(guān)。高表達(dá)LncRNA AK09398患者的總生存時(shí)間及無進(jìn)展生存時(shí)間均較低表達(dá)者明顯縮短；Cox多因素回歸模型分析提示，LncRNA AK09398的表達(dá)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期是SCLC獨(dú)立的預(yù)后因素。以上研究結(jié)果提示LncRNA AK09398參與調(diào)節(jié)SCLC的發(fā)生發(fā)展，可能作為潛在的SCLC預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物。但LncRNA AK09398在調(diào)節(jié)SCLC預(yù)后中的具體作用機(jī)制及參與的信號(hào)通路，尚需進(jìn)行進(jìn)一步分子實(shí)驗(yàn)室及臨床研究。