張海天 王國祥 尹榮 邱滿堂 許林

長非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）廣泛參與了各種生理和疾病過程，在肺癌的發(fā)生和進展過程中也發(fā)揮著重要的調控作用[1,2]。MALAT1是肺癌中最早被鑒定的lncRNA之一，也是肺癌研究領域中研究最多的lncRNA之一，很多研究都證實MALAT1可以促進肺癌的惡性進展[3-5]。

MALAT1在肺癌中的分子機制目前已有相關報道，但是對MALAT1與微小RNA（microRNA, miRNA）的相互調控關系的研究尚少[6,7]。此外目前關于MALAT1與miRNA的研究多是集中在miRNA對MALAT1表達的負性調控[7]，而MALAT1對miRNA表達的調控作用尚未見系統(tǒng)性研究。因此，本研究旨在通過實驗和生物信息手段，系統(tǒng)性地研究MALAT1調控的miRNA。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 A549細胞購買于中國科學院上海細胞庫，H1640培養(yǎng)基購于南京凱基公司，RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒購于Takara公司，TaqMan Low Density Array（TLDA）芯片購于AppliedBiosystems公司，轉染試劑Lipo2000購于Invitrogen公司。實驗所用引物和反義寡核苷酸（antisense oligonucleotides,ASO）于南京金斯瑞公司合成，MAL AT1引物序列：上游5’-GGATCCTAGACCAGCATGCC-3’，下游5’-AAAGGTTACCATAAGTAAGTTCCAGAAAA-3’；β-肌動蛋白引物序列上游：5’-GAAATCGTGCGTGACATTAA-3’，下游：5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’。ASO序列：ASO1：5’-ATGGAGGTATGACATATAAT-3’，ASO2：5’-TCTTATGTTTCCGAACCGTT-3’[3,4]。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉染 A549細胞培養(yǎng)在10%FBS的H1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。將A549細胞接種于六孔板中轉染，使用Lipo2000試劑以終濃度100 nmol/L轉染ASO[4,8]。RT-PCR法檢測MALAT1表達：A549細胞轉染24 h后使用Trizol法提取總RNA，根據試劑盒說明進行逆轉錄反應。RT-PCR反應體系：cDNA 0.5 μL、水3.7 μL、上下游引物各0.4 μL、2×reaction mix 5 μL，使用ABI 7900儀器進行RT-PCR反應，每組實驗均以β-actin作為內參[9,10]。

1.3 TaqMan Low Density Array（TLDA）實驗 A549細胞轉染后提取總RNA并逆轉錄，使用ABI 7900儀器根據制造商說明書進行TLDA芯實驗，使用制造商提供的RQ manage軟件進行數據分析。

1.4 基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA） 將差異表達基因按照差異倍數從高到低排序，使用GSEA軟件中的GseaPreranked選項進行數據分析，miRNA基因集注釋文件下載自GSEA網站[11]。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0軟件完成統(tǒng)計分析。使用Student’st檢驗計算MALAT1表達差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 在A549細胞中敲減MALAT1 在A549細胞中轉染診斷MALAT1的ASO序列和陰性對照序列（scramble），與對照組相比，轉染ASO1和ASO2后MALAT1表達被下調，且ASO1效果更佳（圖1A）。

2.2 TLDA實驗 使用ASO1在A549細胞中敲減MALAT1，通過TLDA實驗檢測miRNA表達變化，以P＜0.05為篩選標準，共發(fā)現131個上調、22個下調的miRNA。

2.3 GSEA分析 GutschnerT在A549細胞中敲減MALAT1后通過基因表達譜芯片發(fā)現458個差異表達基因[3]，本研究對這些差異表達基因進行GSEA分析，發(fā)現有多個miRNA在這些差異表達基因中被顯著富集。

2.4 MALAT1調控的miRNA 將TLDA得到的差異表達miRNA和GSEA富集的miRNA取交集，獲得45個miRNA，進一步篩選表達與調控關系相符的miRNA，最終獲得28個被MALAT1調控的miRNA（表1，圖1B）。根據MALAT1與這些miRNA的表達關系，我們構建了MALAT1-miRNA調控網絡（圖1C）。

3 討論

MALAT1是2004年Ji等[12]發(fā)現的、一個長8,556核苷酸的反義lncRNA，MALAT1位于11號染色體。MALAT1在肺癌組織中顯著高表達，且MALAT1高表達提示患者預后不良[13]，同時體內和體外實驗都證實MALAT1可以促進肺癌細胞侵襲和增殖能力[1,14]。在食管癌、胃癌、肝癌等其他腫瘤中，MALAT1也發(fā)揮著促癌基因作用[15-17]。

圖1 相對于陰性對照序列（scramble），ASO1和ASO2抑制了MALAT1表達水平，ASO1下調作用更佳，*P＜0.05（A）；28個miRNA在TLDA芯片中表達水平，紅色表達上調，綠色表達下調（B）；MALAT1和miRNA調控網絡，藍色：MALAT1，綠色：敲減MALAT1后表達上調miRNA，紅色：敲減MALAT1后表達下調的miRNA（C）。Fig 1 ASO1 and ASO2 significantly inhibited MALAT1 expression level, compared with scramble sequence, and ASO1 showed better inhibitory effect. *P＜0.05 (A). Expression level of the 28 miRNAs in TLDA results, red: up-regulation, green: down-regulation (B); regulatory network of MALAT1 and miRNAs; blue: MALAT1, green: miRNAs up-regulated after MALAT1 knockdown, red: miRNAs down-regualted after MALAT1 knockdown.

關于MALAT1的分子生物學機制已有較多研究，但是對于MALAT1調控miRNA方面研究較少。本研究首先設計并合成了特異性靶向MALAT1的ASO，并有效的敲減了MALAT1的表達。通過TLDA芯片，發(fā)現敲減MALAT1之后很多miRNA表達發(fā)生顯著變化，證實MALAT1會影響miRNA表達，提示miRNA可能通過調控miRNA表達來發(fā)揮生物學功能。Gutschner等[3]通過ZFN技術敲減了MALAT1，并發(fā)現了458個差異表達基因，我們使用GSEA方法分析了這些差異表達基因，尋找這些基因中被富集的miRNA結合位點。GSEA可以分析一個預先定義的基因集是否被富集[9]。敲減MALAT1后miRNA表達下調，則miRNA靶基因表達上調；對差異表達基因GSEA分析，miRNA會被正性富集。因此，在對TLDA和GSEA取交集的45個miRNA中進一步篩選出下調-正性富集和上調-負性富集的28miRNA，即這28個miRNA是被MALAT1調控的miRNA。

Tripathi等[4]首先報道MALAT1可以影響RNA剪切，而后Gutschner等[3]通過芯片分析發(fā)現MALAT1敲減之后對RNA剪切影響不大，而對基因表達水平有重要影響，提示MALAT1可以調控基因轉錄。之后，諸多研究[17,18]發(fā)現MALAT1可以通過與RNA結合蛋白綁定調控下游基因的轉錄。因此MALTA1也可能通過與RNA結合蛋白綁定直接調控miRNA轉錄；此外，受MALAT1調控的基因也可能間接調控miRNA表達。然而，對于本研究鑒定出的28個miRNA，還需進一步實驗來明確MALAT1具體是通過何種機制調控這些miRNA的表達。

表1 28個MALAT1調控的miRNATab 1 28 miRNAs regulated by MALAT1

本研究通過實驗和生物信息學分析手段、系統(tǒng)性地研究了MALTAT1調控的miRNA，為進一步研究MALAT1和miRNA的調控網絡提供了參考。