賀元辰，厲志，韓勁松，王輝山

· 論著 ·

低溫對(duì)創(chuàng)傷性失血性休克豬血小板ADP抑制率的影響

賀元辰1，2，厲志2，韓勁松2，王輝山2

目的 探討在創(chuàng)傷性失血性休克豬模型中低溫對(duì)血小板ADP抑制率的影響。方法 健康成年巴馬香豬10只，建立創(chuàng)傷性失血性休克模型，分別在休克前（T0）、休克后1h（T1）、低溫34℃（T2）、低溫30℃（T3）時(shí)留取靜脈血檢測(cè)血小板ADP抑制率以及計(jì)算休克指數(shù)。結(jié)果 休克后ADP受體抑制率明顯高于休克前［（91.83±5.63）% vs. （83.69±3.68）%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。休克指數(shù)與ADP受體抑制率呈正相關(guān)（r=0.8343，P＜0.001）。當(dāng)溫度降到34℃時(shí)，ADP受體抑制率較降溫前顯著的下降［（84.64±4.14）% vs. （91.83±5.63）%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。溫度繼續(xù)下降到30℃，ADP受體抑制率仍然繼續(xù)下降［（84.64±4.14）% vs. （77.62±4.80）%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。結(jié)論 在創(chuàng)傷性失血性休克豬模型中，休克時(shí)ADP抑制率明顯升高，增加出血風(fēng)險(xiǎn)，但低溫使ADP受體抑制率明顯下降。

低溫；創(chuàng)傷性失血性休克；ADP抑制率

在戰(zhàn)爭(zhēng)期間，創(chuàng)傷性失血性休克（THS）經(jīng)常發(fā)生，占戰(zhàn)爭(zhēng)士兵死亡的50%，而失血仍然是創(chuàng)傷后致死的主要原因之一［1］。由于嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致組織損傷，引起機(jī)體出現(xiàn)以凝血功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的臨床癥狀，稱為急性創(chuàng)傷后凝血?。ˋTC）亦稱為“微血管出血”。創(chuàng)傷患者ATC的發(fā)生率為25%［2］，而關(guān)于ATC的研究集中在其引起的彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC）方面［3］。最近的研究表明創(chuàng)傷后早期的血小板抑制是組織創(chuàng)傷和失血性休克的主要危險(xiǎn)因素［4］。雖然創(chuàng)傷后血小板計(jì)數(shù)的平均數(shù)在正常范圍，但是功能已經(jīng)改變。常規(guī)檢驗(yàn)并不能確定血小板功能（除非嚴(yán)重紊亂），血小板圖可快速識(shí)別和發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷中高危患者［5］。低溫在臨床上應(yīng)用廣泛，在特定的外科手術(shù)中可減少大腦、心臟和腎臟等器官的氧氣需求，從而發(fā)揮保護(hù)作用。最近研究表明［4］，低溫對(duì)血小板有激活作用，打破了傳統(tǒng)的觀念。創(chuàng)傷性失血性休克中低溫對(duì)血小板的作用如何，仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)研究，應(yīng)用創(chuàng)傷性失血性休克豬模型分析低溫對(duì)血小板ADP受體抑制率的作用及調(diào)控機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康成年巴馬香豬10只，均為雄性，體重在17～25kg之間。合格證號(hào)SYXK（軍）2007-001，黑龍江雙鴨山市實(shí)創(chuàng)科技小型豬養(yǎng)殖中心提供。

1.1.2試劑和儀器 丙泊酚（上海阿斯利康有限公司），氯胺酮（廣州益滿生物科技有限公司），阿托品（上海譜振生物有限公司），異氟醚（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）。Datex-OhmedaS/5多功能監(jiān)護(hù)儀（日本E-O公司），Vigilance心排量監(jiān)護(hù)儀（美國(guó)愛(ài)德華生命科學(xué)公司），中心靜脈導(dǎo)管及肺動(dòng)脈漂浮導(dǎo)管（美國(guó)愛(ài)德華生命科學(xué)公司），SD/SC-376BP型低溫冷柜（浙江星星公司），Datex-Ohmeda9300麻醉機(jī)（美國(guó)R＆D公司），TEG5000型TEG分析儀（美國(guó)Haemoscope公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1麻醉方法 麻醉誘導(dǎo)采用肌肉注射氯胺酮及阿托品（氯胺酮按20 mg/kg計(jì)算，阿托品為0.5 mg），濃度為1.5%～2.0%的異氟醚面罩吸入，待豬完全麻醉后行氣管內(nèi)插管，呼吸機(jī)輔助呼吸。呼吸參數(shù)調(diào)整為：頻率14～16 次/min，潮氣量按10 ml/kg設(shè)置，F(xiàn)iO2為25%，F(xiàn)iN2為75%，此模式可將PO2維持在100 mmHg左右，PCO2維持在40 mmHg左右。在無(wú)菌條件下切開(kāi)右側(cè)頸部皮膚，分離右側(cè)頸動(dòng)脈，插入導(dǎo)管，用于放血；將右側(cè)腹股溝區(qū)皮膚切開(kāi)，顯露右側(cè)股動(dòng)脈及股靜脈，分別進(jìn)行動(dòng)靜脈穿刺并固定，用于采集血液、監(jiān)測(cè)血壓和中心靜脈壓等；將溫敏電極放置直腸內(nèi)用于監(jiān)測(cè)直腸溫度。外科操作在1 h內(nèi)完成，手術(shù)過(guò)程中豬的下面使用保溫毯，手術(shù)臺(tái)周圍用燈光進(jìn)行加溫，將豬的核心體溫維持在38.5℃～39.5℃。操作結(jié)束后將吸入異氟醚的濃度調(diào)整為1.0%～1.5%確保豬不發(fā)生躁動(dòng)（以四肢無(wú)扭動(dòng)為標(biāo)準(zhǔn)），穩(wěn)定1 h后開(kāi)始基礎(chǔ)檢測(cè)及模型建立。

1.2.2建立模型 通過(guò)頸動(dòng)脈在15 min內(nèi)勻速放出全身40%的血量（按30 ml/kg體重計(jì)算）后視為休克。放血開(kāi)始前記錄時(shí)間為T(mén)0。在放血期間動(dòng)物出現(xiàn)躁動(dòng)等應(yīng)激性表現(xiàn)時(shí)可給予嗎啡1.5 mg靜脈注射，當(dāng)嗎啡劑量飽和后，可換成維庫(kù)溴銨靜脈注射（0.2 mg/kg）。待休克后1 h記為T(mén)1，放入冰柜里進(jìn)行降溫使核心溫度降到34℃，穩(wěn)定在這個(gè)溫度1 h記為T(mén)2，再將溫度繼續(xù)降到30℃時(shí)再穩(wěn)定1 h記為T(mén)3。分別在休克前（T0）、休克后1h （T1）、低溫34℃（T2）、低溫30℃（T3）時(shí)留取靜脈血等待檢測(cè)。

1.2.3檢測(cè)方法 ①血栓彈力圖（TEG）檢測(cè)：使用美國(guó)Haemoscope公司生產(chǎn)的TEG5000型TEG分析儀和分析軟件（TAS），檢測(cè)試劑為改良高嶺土，促進(jìn)劑為C-Kaolin。于各時(shí)間點(diǎn)采4.5 ml靜脈血加入含有0.5 ml 3.2%枸櫞酸鈉（1：9）聚丙烯試管內(nèi)，封口后上下翻轉(zhuǎn)5次，使血與枸櫞酸鈉混合，取340 μl上樣，加CaCl220μl檢測(cè)。電腦記錄TEG曲線參數(shù)包括：凝血反應(yīng)時(shí)間（R）、凝血形成時(shí)間（K）、凝血形成速率（Angle）、凝血最終強(qiáng)度（MA）、凝血綜合指數(shù)（CI）。②血小板圖檢測(cè)：TEG血小板功能分析試驗(yàn)分析血小板功能，測(cè)量血小板對(duì)激活劑花生四烯酸（AA）和二磷酸腺苷（ADP）的反應(yīng)性。收集的樣品分四次測(cè)量，分別為MAThrombin、MAFibrin、MAADP、MAAA，計(jì)算ADP受體抑制率=［（MAADP-MAFibrin）/（MAThrombin-MAFibrin）×100］和休克指數(shù)（SI）=心率/收縮壓。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0軟件。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，休克指數(shù)與ADP受體抑制率之間的相關(guān)性采用Pearson's相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1低溫及休克時(shí)血小板ADP受體抑制率的變化休克后ADP受體抑制率明顯高于休克前［（91.83 ±5.63）% vs. （83.69±3.68）%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1），提示休克抑制血小板的活化，導(dǎo)致出血的風(fēng)險(xiǎn)增加。休克指數(shù)與ADP受體抑制率呈正相關(guān)（r=0.8343，P＜0.001）（圖2），說(shuō)明休克越嚴(yán)重，血小板活化度就越差，出血的風(fēng)險(xiǎn)就越高。當(dāng)溫度降到34℃時(shí)，ADP受體抑制率較降溫前顯著的下降［（84.64± 4.14）% vs. （91.83±5.63）%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖3），說(shuō)明低溫對(duì)血小板有激活作用，而且能夠?qū)剐菘藢?duì)血小板的抑制作用。溫度繼續(xù)下降到30℃，ADP受體抑制率仍然繼續(xù)下降［（84.64±4.14）% vs. （77.62± 4.80）%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖4），繼續(xù)加快凝血速率。

3　討論

圖1　休克前后ADP受體抑制率的變化（n=10）

圖2　ADP受體抑制率與休克指數(shù)的相關(guān)分析（n=10）

圖3　休克后與低溫34℃ ADP受體抑制率的變化（n=10）

圖4　不同溫度下ADP受體抑制率的變化（n=10）

據(jù)報(bào)道，美軍在阿富汗戰(zhàn)場(chǎng)上的傷病員經(jīng)常要在零下的環(huán)境中經(jīng)過(guò)4～6 h才被送到戰(zhàn)地醫(yī)院進(jìn)行進(jìn)一步的救治［6］，因此在低溫環(huán)境下研究創(chuàng)傷性失血性休克自然病程的變化顯得尤為重要。豬的心血管系統(tǒng)及體溫調(diào)控機(jī)制等與人相似，常用于研究創(chuàng)傷性失血性休克對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的影響，故本實(shí)驗(yàn)采用豬創(chuàng)傷性失血性休克模型。

創(chuàng)傷引起的急性凝血病的研究大多集中在DIC上［7，8］，在止血過(guò)程中，血小板占據(jù)重要的地位。血小板圖可以在床旁測(cè)量血小板功能［9］，在臨床中應(yīng)用較為廣泛，例如，在心臟手術(shù)中服用抗凝劑患者的ADP受體抑制率＞60%就可以確定出血并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)［10-12］。但關(guān)于創(chuàng)傷后血小板功能的研究甚少［7］。在分析越南戰(zhàn)爭(zhēng)期間人員傷亡時(shí)，第一次提到早期血小板功能障礙，隨后在大量輸血的人群中，建議先輸注血小板以減少微血管的出血［13］。近期回顧性研究表明［14］，預(yù)先輸注血小板可能減少創(chuàng)傷性凝血?。?5，16］。創(chuàng)傷后早期大量ADP通過(guò)組織損傷釋放到體循環(huán)中，血小板過(guò)度激活致使血小板對(duì)隨后的刺激無(wú)反應(yīng)，導(dǎo)致凝血功能障礙。創(chuàng)傷后早期由于大量血小板反應(yīng)性的降低，ADP受體抑制率的升高，血小板功能異常，這與我們的研究結(jié)果一致。

低溫對(duì)血小板的作用說(shuō)法不一，以往研究表明低溫對(duì)血小板起到抑制作用，而最近有報(bào)道稱低溫對(duì)血小板起到激活的作用［4］。低溫可能通過(guò)增加紅細(xì)胞的比容，血小板形狀的變化，降低血流量，增加粘附分子的表達(dá)，促進(jìn)血小板的邊集，達(dá)到增強(qiáng)凝血的作用。低溫還可能通過(guò)增加剪切力的作用，引起血小板的聚集［17］。最初血小板活化通過(guò)有效的激活劑，例如凝血酶、ADP、膠原蛋白，而血小板激活劑ADP在低溫引起血小板活化中占據(jù)著至關(guān)重要的位置。在低溫中，ADP新陳代謝主要酶CD39的活性顯著下降，導(dǎo)致較低的水解速率，ADP水解的減少將會(huì)使血漿中ADP的濃度再一次的增加，使得血小板活化，而活化的血小板又能引起自身致密顆粒釋放ADP，進(jìn)而吸引循環(huán)中更多的血小板，擴(kuò)大了活化的途徑（ADP擴(kuò)大旁路）。低溫還能增加血小板對(duì)激活刺激的反應(yīng)能力，加強(qiáng)了血小板止血栓的形成和血栓的穩(wěn)定性。血小板ADP受體P2Y12的阻滯減少了低溫引起的血小板粘連和聚集。ADP受體的抑制和ADP的水解阻止了低溫引起的血小板活化。低溫對(duì)血小板主要的作用是誘發(fā)凝血事件，也就是血小板激活典型的標(biāo)志（GPIIb/IIIa活化和P選擇蛋白的表達(dá)）。

本實(shí)驗(yàn)分析了在創(chuàng)傷性失血性休克豬模型中低溫對(duì)其血小板的影響，結(jié)果顯示，低溫使ADP受體抑制率明顯下降，加快了凝血的速率，這也表明低溫使創(chuàng)傷性失血性休克獲益。

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本文編輯：姚雪莉

Influence of hypothermia on inhibitory rate of platelet ADP receptor in pig model of traumatic hemorrhagic shock

HE Yuan-chen*， LI Zhi， HAN Jing-song， WANG Hui-shan.*Graduate School， Fourth Military Medical University， Xi'an 710032， China.

WANG Hui-shan， E-mail: huishanwang@hotmail.com

Objective To investigate the influence of hypothermia on inhibitory rate of platelet ADP receptor in pig model of traumatic hemorrhagic shock （THS）. Methods The model of THS was established in health adult Bama miniature pigs （n=10）. The inhibitory rate of platelet ADP receptor was detected and shock index was calculated respectively before THS （T0）， 1 h after THS （T1）， and when temperature was 34℃ （T2） and was 30℃ （T3）. Results The inhibitory rate of platelet ADP receptor was significantly higher after THS than before ［（91.83±5.63）% vs. （83.69 ±3.68）%， P＜0.01］. The shock index was positively correlated to inhibitory rate of platelet ADP receptor （r=0.8343，P＜0.001）. When temperature decreased to 34℃， inhibitory rate of platelet ADP receptor decreased significantly than before ［（84.64±4.14）% vs. （91.83±5.63）%， P＜0.01］. When temperature continuously decreased to 30℃， inhibitory rate of platelet ADP receptor continuously decreased ［（84.64±4.14）% vs. （77.62±4.80）%， P＜0.01］. Conclusion In pig model of THS， the inhibitory rate of platelet ADP receptor increases significantly when shocking and bleed risk increases， while hypothermia can significantly reduce inhibitory rate of platelet ADP receptor.

Hypothermia； Traumatic hemorrhagic shock； Inhibitory rate of platelet ADP

R541.64

A

1674-4055（2016）04-0418-03

2013年軍隊(duì)裝備研制項(xiàng)目重大項(xiàng)目（ASY13J001）

1710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)研究生院；2110016 沈陽(yáng)，沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院心外科

王輝山，E-mail：huishanwang@hotmail.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.04.10