王冬武，鄧時銘，鄒利，李紹明，蔣國民（.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南　長沙　4053；2.湖南漁緣生物科技有限公司，湖南　長沙　4053）

不同錦鯉血液指標(biāo)比較研究

王冬武1，2，鄧時銘1，鄒利1，李紹明1，2，蔣國民1
（1.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南長沙410153；2.湖南漁緣生物科技有限公司，湖南長沙410153）

研究分析相同條件下錦鯉的血細(xì)胞、吞噬能力和酶活性指標(biāo)，結(jié)果顯示：紅白錦鯉的紅、白細(xì)胞數(shù)目最大，中性粒細(xì)胞對葡萄球菌吞噬百分比和NBT%最高，分別達(dá)到（46.75±3.39）%和（61±5.66）%；不同錦鯉的AKP、ACP、T-SOD差異無統(tǒng)計學(xué)意義。由此看出，不同錦鯉非特異性免疫能力、免疫過程不盡相同，紅白和三色錦鯉先吞噬后胞內(nèi)殺傷菌體，黃金則是直接溶解菌體來完成。

錦鯉；血液指標(biāo)；比較研究

doi：10.3969/j.issn.1004-2091.2016.04.001

錦鯉是一種較低等的變溫動物，機體特異性免疫能力較差，主要依靠非特異免疫來防御疾病，而非特異性免疫防御機制中，主要由具有吞噬活力的中性粒細(xì)胞及由相關(guān)細(xì)胞分泌的溶菌酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶等起作用，其能力的高低可用相應(yīng)指標(biāo)來反映，如紅白細(xì)胞數(shù)量、免疫細(xì)胞活性、酶活性指標(biāo)等。因此血液是魚類機體重要組成部分，更是機體免疫系統(tǒng)的重要組成［1］。

魚類血液指標(biāo)能反映機體生理狀態(tài)和健康情況，檢測血液指標(biāo)，對于魚病的預(yù)防和診斷、致病環(huán)境的評估與確定具有一定的指導(dǎo)意義［2-3］。該實驗比較研究不同品種錦鯉血液細(xì)胞種類、形態(tài)大小、吞噬活性及酶活性等有關(guān)非特性免疫指標(biāo)，了解機體適應(yīng)能力，豐富魚類比較免疫學(xué)知識和錦鯉血液生理基礎(chǔ)知識，提供品種選擇、種質(zhì)優(yōu)化、病害生態(tài)防控及漁藥開發(fā)等理論依據(jù)，因此具有較高的研究及應(yīng)用價值。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1錦鯉紅白、黃金和大正三色錦鯉同一批次統(tǒng)一管理的當(dāng)年魚種，體質(zhì)健壯、外表無傷、規(guī)格一致。

1.1.2抗凝血尾靜脈采血，放于無菌離心管中，肝素鈉溶液抗凝，4℃保存?zhèn)溆?，?dāng)天測完。

1.1.3血清樣尾靜脈采血，室溫放置凝固2 h，2 000 r/min離心10 min。取上清液-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4金黃葡萄球菌革蘭陽性菌，由湖南省水產(chǎn)科學(xué)所病害室提供。

1.2實驗方法

1.2.1血細(xì)胞計數(shù)［4］采用Neubauer（牛鮑）計數(shù)板，計數(shù)原則是數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線。每組重復(fù)4次。

紅細(xì)胞計數(shù)：0.65%滅菌生理鹽水稀釋抗凝血液400倍再計數(shù)。

白細(xì)胞計數(shù)：白細(xì)胞稀釋液稀釋40倍，室溫放置15 min，待紅細(xì)胞溶解后再計數(shù)。

1.2.2血液涂片取抗凝血涂片，瑞士（Wright′s）染色，顯微鏡下觀察并拍照。每組重復(fù)4次，隨機測量200個紅細(xì)胞的長短徑。

1.2.3中性粒細(xì)胞吞噬功能［5］抗凝血液100 μL，加滅活105個細(xì)胞/mL金黃葡萄球菌50 μL，混勻，置濕盒內(nèi)，放28℃恒溫孵育30 min，間隔10 min搖勻一次。

取培養(yǎng)液涂片，瑞士染色，油鏡觀察，統(tǒng)計200個中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌總數(shù)及參與吞噬的中性粒細(xì)胞數(shù)目，分別算出吞噬百分比和吞噬指數(shù)。

吞噬百分率（PP）=（吞噬細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)/200個中性粒細(xì)胞）×100%

吞噬指數(shù)（PI）=（200個中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌的總數(shù)/200個中性粒細(xì)胞）×100%

1.2.4硝基蘭四氮唑（NBT）試驗［5］凝血100 μL，加入等量NBT使用液，混勻，置濕盒內(nèi)，放28℃恒溫孵育25 min，期間搖勻2次。將上述培養(yǎng)液放置室溫15 min，搖勻，取培養(yǎng)液涂片，瑞士染色，油鏡觀察，計算100個中性粒細(xì)胞中NBT細(xì)胞的個數(shù)。中性粒細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有點狀或塊狀藍(lán)黑色甲簪顆粒的細(xì)胞為NBT陽性細(xì)胞。

1.2.5血液酶測定分析取不同錦鯉血清樣品，按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行溶菌酶（LSZ）比濁法測定堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）及總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性檢測。試劑盒購買于南京建成生物工程研究所。

按照自身對照法測定血清溶菌酶。溶菌酶活力（U/mL）=［（T樣品-T樣品0）/（T標(biāo)準(zhǔn)-T標(biāo)準(zhǔn)0）］×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣品稀釋倍數(shù)；堿性磷酸酶（U/100 mL）：100 mL血清在37℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位；酸性磷酸酶（U/100 mL）：100 mL血清在37℃與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個活力單位；總超氧化物歧化酶（U/mL）：每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位。

1.2.6數(shù)據(jù)處理用軟件SPSS對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和差異統(tǒng)計學(xué)意義分析（Compare Means Independent-Samples T-test），顯著性檢驗水平為P＜0.5，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié)果

2.1錦鯉血細(xì)胞形態(tài)學(xué)特性比較

2.1.1血細(xì)胞種類與形態(tài)特征瑞士染色后的涂片，Olympus顯微鏡觀察并拍照（圖1）。三種錦鯉細(xì)胞種類相同，有紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、單核細(xì)胞和血栓細(xì)胞，瑞士染色后，呈現(xiàn)不同顏色。

紅細(xì)胞（Erythrocyte）：核紫紅色，胞漿為橘紅色，核為橢圓形（圖1-1—1-3）；淋巴細(xì)胞（Lymphocyte）：胞漿為藍(lán)灰色，核為紫紅色，胞漿少，核幾乎占住整個細(xì)胞（圖1-4）；嗜堿性細(xì)胞（Basophil）：核顆粒紫紅色或黑色圓形顆粒，胞漿呈藍(lán)色，核橢圓形（圖1-5）；嗜中性粒細(xì)胞（Neutrophil）：核顆粒紫色或紫紅色，胞漿呈淡紫紅色，核橢圓形（圖1-6）；嗜酸性細(xì)胞（Eosinophil）：胞漿為紅色或橘紅色，核顆粒為紅色，核橢圓形（圖1-7）；單核細(xì)胞（Monocyte）：核偏于一側(cè)或居中，核腎型，染色較疏松，胞漿藍(lán)灰色，呈網(wǎng)狀，常見空泡（圖1-8）；血栓細(xì)胞（Thrombocyte）：白細(xì)胞一種，核呈桿狀，呈紫紅色，胞漿非常少，呈淡紅色（圖1-9）。在粒細(xì)胞中，細(xì)胞核多為橢圓形或腎形單核，很少見多核仁，核居中或偏位。

2.1.2血細(xì)胞數(shù)目與大小顯微鏡下統(tǒng)計紅白細(xì)胞數(shù)目，血液涂片拍照，隨機測量紅細(xì)胞長、短徑，計算長、短徑比并進(jìn)行顯著性分析（表1）。

表1　紅白細(xì)胞數(shù)目及紅細(xì)胞長、短徑比

3種錦鯉紅細(xì)胞長短徑比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），三色和黃金錦鯉紅細(xì)胞數(shù)目差異不無統(tǒng)計學(xué)意義，明顯少于紅白錦鯉數(shù)目，差異極有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），紅白錦鯉白細(xì)胞數(shù)量最多，其次三色鏡鯉和黃金，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2錦鯉血液生化特性比較

2.2.1中性粒細(xì)胞性能比較光學(xué)顯微鏡下觀察統(tǒng)計不同錦鯉中性粒細(xì)胞的吞噬活性，進(jìn)行顯著性分析（見表2）和拍照（圖1-10——圖1-11），可明顯看出錦鯉中性粒細(xì)胞均有不同程度的吞噬菌體，紅細(xì)胞無吞噬或黏附功能（圖1-12）。

中性粒細(xì)胞的吞噬百分比和NBT陽性百分比由高到低是紅白錦鯉＞三色錦鯉＞黃金錦鯉，黃金錦鯉中性粒細(xì)胞吞噬指數(shù)高于其他2種錦鯉，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2.2錦鯉血液酶活性比較檢測不同錦鯉血清溶菌酶（LSZ）、堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）和總氧化物歧化酶（T-SOD）活性，實驗數(shù)據(jù)見表3。三種魚類的AKP、ACP和T-SOD活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），黃金錦鯉LSZ活性高于三色和紅白錦鯉，差異極有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

3　討論與分析

表2　中性粒細(xì)胞吞噬活性比較　%

表3　錦鯉血液酶活力比較

3.1紅細(xì)胞

血液是魚體內(nèi)一種極為重要的組織，參與機體代謝、營養(yǎng)及免疫等過程，在一定程度反映著機體免疫水平，而紅細(xì)胞是魚類外周血細(xì)胞的主要組成，在機體內(nèi)發(fā)揮著重要作用［6］。大量研究表明，魚類紅細(xì)胞具有攜帶與運輸氧氣的功能，個體越小，數(shù)量越多，攜氧能力越強，而且還具有黏附或吞噬異物功能。王旭東［7］、馮守明［8］等發(fā)現(xiàn)大部分魚類紅細(xì)胞表面C3b受體能與酵母菌結(jié)合形成花環(huán)，或吞噬酵母，顯示一定的免疫功能。該實驗3種錦鯉紅細(xì)胞長短徑比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，也就是紅細(xì)胞個體大小差異不明顯，而紅細(xì)胞數(shù)量多的紅白錦鯉，表明著其攜帶與運輸氧氣、機體呼吸機能也就強；在血液涂片和吞噬試驗中均未見黏附、吞噬葡萄球菌，或NBT陽性紅細(xì)胞，可能是實驗錦鯉紅細(xì)胞膜上沒有黏附免疫復(fù)合物（IC），使葡萄球菌無法與IC 中IgGFc段相結(jié)合，無法清除葡萄球菌。

3.2中性粒細(xì)胞

吞噬主要由中性粒細(xì)胞，少量單核細(xì)胞完成，是一種比較重要的免疫途徑和方式，是魚類機體免疫功能的重要組成部分，能吞噬和消滅病原微生物的作用。中性粒細(xì)胞的吞噬百分比和NBT陽性率高低反映細(xì)胞吞噬與殺菌能力的強弱，結(jié)合白細(xì)胞數(shù)量的大小又反映出機體的非特異性免疫能力的高低［9］。實驗中3種錦鯉吞噬百分比以紅白錦鯉最高，其次是三色錦鯉和黃金錦鯉，都顯示著較強的吞噬能力；實驗錦鯉NBT陽性率均大于29%，根據(jù)學(xué)者沈玉清［5］研究，表示實驗對象中性粒細(xì)胞吞噬功能正常，以紅白錦鯉最高，同時也表明中性粒細(xì)胞在吞噬菌體過程中，還伴隨呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量超氧陰離子和活性氧，能直接殺傷胞內(nèi)菌體，清除異物，以紅白錦鯉為之最；魚體白細(xì)胞數(shù)量越多，魚抗病能力越強［10］，而實驗魚白細(xì)胞數(shù)量依次紅白錦鯉＞三色鏡鯉＞黃金錦鯉，說明紅白錦鯉更能適宜不良環(huán)境，顯示出更強的抵抗力。從吞噬百分比、NBT%和白細(xì)胞數(shù)目變化趨勢來看，均以紅白錦鯉為最高，在一定程度上反映出其非特異性免疫能力較強。

3.3體液免疫因子

魚類非特異性免疫防御體系清除異物過程中，不但有大量免疫細(xì)胞參與，而且還有許多高活性的免疫因子，其中AKP、ACP、T-SOD和LSZ的活性常被作為衡量機體免疫能力的參照指標(biāo)。AKP、ACP等酶能參與消化、降解中性粒細(xì)胞吞噬的顆粒物，LSZ可直接溶解菌體，尤其革蘭陽性菌，在機體免疫過程中起到極其重要的作用。3種實驗錦鯉AKP、ACP、T-SOD活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，LSZ活性差異明顯，以黃金錦鯉最高，極有統(tǒng)計學(xué)意義地大于紅白錦鯉和三色錦鯉。這免疫因子的不同活性，可能顯示著魚類機體在處理革蘭陽性菌非特異性免疫過程的不同，紅白和三色錦鯉可能是先吞噬，后胞內(nèi)殺菌為主，黃金錦鯉可能以高活性溶菌酶直接溶菌為主。

4　結(jié)論

結(jié)合血細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)、功能與體液免疫因子，可得：在相同培育條件下，不同錦鯉機體非特異性免疫能力強弱有所不同，以紅白錦鯉為最強，不同錦鯉機體處理革蘭陽性菌的非特異性免疫過程也不盡相同。

［1］Zhou Yongcan，Xing Yuna，F(xiàn)eng Quanying.Reserch advance in haemocytes of fisher［J］.Journal of Hainan University: Natural Science Ed，2003（2）:171-176.

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［3］Pavlidis M，F(xiàn)utter W C，Katharios P，et al.Blood cell profile of six Mediterranean mariculture fish species［J］.Journal of Applied Ichthyology，2007，23（1）:70-73.

［4］林浩然.魚類生理學(xué) ［M］.廣州:廣東高等教育出版社，1999，82-87.

［5］沈玉清，高德華.免疫學(xué)與血液檢驗學(xué)［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1989：131-133.

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［9］聶品.魚類非特異性免疫研究的新進(jìn)展 ［J］.水產(chǎn)學(xué)報，1997，21（1）：69-73.

［10］卓孝磊，梁日深，梁桂洪，等.月鱧、烏鱧和斑鱧血液指標(biāo)、血細(xì)胞比較分析［J］.科技導(dǎo)報，2008，26（13）：84-87.（收稿日期：2015-11-23）

Studied on the hematological indices of different Cyprinus carpio Koi

Wang Dongwu1，2，Deng Shiming1，Zou Li1，Li Shaoming1，2，Jiang Guomin1
（1.Fisheries Research Institute of Hunan Province，Changsha 410153，China；2，Hunan yuyuan Biological Technology Co.，Ltd.Changsha 410153，China）

The blood cell count，phagocytosis to Staphyloccocus aureus and enzyme activities of Cyprinus carpio Koi in the same environmental conditions were studied in the paper.The results showed that the counts of Kohaku'erythrocytes and leucocytes were the biggest among the experimental Cyprinus carpio Koi and the maximal rate of haemocytes phagocytosis to Staphyloccocus aureus and nitroblue tetrazolium（NBT）of Kohaku were （46.75±3.39）%and（61±5.66）%；the difference was not statistically significant among the acid phosphatase activities，alkaline phosphatase activities and total superoxide dismutase activities.So from the experimental result point of view，it was possible the nonspecific immunity ability of experimental fish and the process to deal withgram-positive bacteria were not equal，the cells of Kohaku and T﹒Sanke might phagocytose gram-positive bacteria and then kill them，but Yamabakiogon may kill gram-positive bacteria directly with lysozyme.

Cyprinus carpio Koi；hematological indices；comparative study

圖1　細(xì)胞圖

Q176

A

1004-2091（2016）04-0001-05

長沙市科技計劃產(chǎn)學(xué)研金合作資金專項（K1201136-21）

王冬武（1968-），男，碩士，研究員，主要從事魚類遺傳方面研究，E-mail:1309128968@qq.com

鄧時銘（1974-），女，主要從事魚類免疫學(xué)方面研究，E-mail:dsmjgm@163.com