姜光明，錢彩源，顧雪林，魏賓，徐樂，宋學(xué)宏（.蘇州市吳中區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇　蘇州　58；.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇　蘇州　53）

中華絨螯蟹和克氏原螯蝦細(xì)菌性敗血癥病原學(xué)研究

姜光明1，錢彩源1，顧雪林1，魏賓1，徐樂2，宋學(xué)宏2
（1.蘇州市吳中區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇蘇州215128；2.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州215123）

從一中華絨螯蟹和克氏原螯蝦混養(yǎng)池的自然發(fā)生敗血癥的個(gè)體中分離到2株細(xì)菌，對(duì)其生物學(xué)性狀、致病性及藥物敏感性進(jìn)行分析，旨在明確分離菌的種類、病原學(xué)意義及耐藥特征。從發(fā)病蟹和蝦的血液中分離細(xì)菌并獲純培養(yǎng)，通過對(duì)純培養(yǎng)菌的形態(tài)特征、理化特性、16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，鑒定菌種。以不同濃度的分離菌懸液感染健康蟹和蝦，測(cè)定其致病性；用瓊脂擴(kuò)散法和稀釋法測(cè)定分離菌株對(duì)9種常用抗菌類藥物的敏感性。分離出純培養(yǎng)的2株菌分別鑒定為維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）和弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）；2株菌均具有較強(qiáng)致病性，對(duì)氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星、乳酸諾氟沙星、鹽酸諾氟沙星等4種抗生素敏感。

中華絨螯蟹；克氏原螯蝦；細(xì)菌性敗血癥；維氏氣單胞菌；弗氏檸檬酸桿菌；藥物敏感性

doi：10.3969/j.issn.1004-2091.2016.04.010

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）俗稱河蟹，克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）俗稱小龍蝦，均屬甲殼動(dòng)物，為水產(chǎn)養(yǎng)殖的名貴品種，也是江蘇省十大主推養(yǎng)殖品種。相比于產(chǎn)量在750 kg/667 m2以上的魚類養(yǎng)殖而言，河蟹與小龍蝦的養(yǎng)殖屬于低密度養(yǎng)殖，而且近年來不少地方實(shí)行蝦蟹混養(yǎng)的生態(tài)養(yǎng)殖模式，絕大多數(shù)池塘的承載量不高于150 kg/667 m2，但隨著養(yǎng)殖年限的增加，養(yǎng)殖水源的污染日趨嚴(yán)重，導(dǎo)致蝦蟹免疫力持續(xù)下降，而水體條件致病菌毒力上升、致病力增強(qiáng)，因而引發(fā)蝦蟹細(xì)菌性傳染病，養(yǎng)殖者常采用內(nèi)服抗生素與外潑消毒劑，以及微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)水質(zhì)相結(jié)合的方法預(yù)防與治療此類疾病，但防治效果越來越不穩(wěn)定，給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

在蘇州某養(yǎng)殖區(qū)域，養(yǎng)殖者采取中華絨螯蟹和克氏原螯蝦混養(yǎng)模式，近年來養(yǎng)殖綜合效益較好。但從2013年以來，作者在病害調(diào)查工作中發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)從6月下旬開始，克氏原螯蝦有部分死亡，至7月中旬中華絨螯蟹也出現(xiàn)死亡。該病發(fā)病率達(dá)30%以上，發(fā)病池的蝦、蟹病死率達(dá)30%～50%，采用內(nèi)服氟喹諾酮類抗生素及外潑氯制劑的方法治療，其效果在2013年還較明顯，但至2015年治愈率較低。鑒于這一現(xiàn)狀，作者對(duì)該病的病原生物進(jìn)行了分離調(diào)查，旨在明確該病的病原及其耐藥情況，為該病的有效防治提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1材料來源

病蝦、蟹采集于蘇州吳中區(qū)東山某養(yǎng)殖池塘，健康蝦、蟹購于吳中區(qū)臨湖某養(yǎng)殖場(chǎng)，中華絨螯蟹體質(zhì)量23～25 g，克氏原螯蝦體質(zhì)量14～16 g。健康蝦、蟹放在60 cm×40 cm×40 cm室內(nèi)水族箱中馴養(yǎng)1周，水深保持20 cm左右。馴養(yǎng)期間投喂2%的商品飼料，每天換1/4的水、氣泵增氧，水溫保持（28± 1）℃。馴養(yǎng)結(jié)束后，取活動(dòng)正常的蝦、蟹進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2細(xì)菌分離及菌懸液的制備

取發(fā)病蝦、蟹各5只，用酒精棉消毒發(fā)病蝦蟹體表，無菌取血0.1 mL，涂布RS瓊脂平板，37℃培養(yǎng)10～14 h，觀察菌落形態(tài)。再用接種環(huán)挑取兩株優(yōu)勢(shì)菌落的單個(gè)菌落（菌落數(shù)分別約占68%和32%），劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37℃純培養(yǎng)18～24 h，分別加終濃度為30%的甘油，-20℃保存用于進(jìn)一步鑒定。分離的優(yōu)勢(shì)菌株編號(hào)分別為AH3和CF，將AH3和CF菌株分別接于新鮮營養(yǎng)瓊脂斜面，經(jīng)28℃恒溫培養(yǎng)18～20 h，用0.70%的無菌生理鹽水洗下菌苔，制成菌懸液濃度為5.0×108 CFU/mL備用。

1.3人工感染試驗(yàn)

取上述分離的2株代表菌，移接于普通營養(yǎng)肉湯管28℃培養(yǎng)18 h后，分別用0.70%的無菌生理鹽水稀釋成含量為5.0×107、5.0×106、5.0×105、5.0× 104、5.0×103CFU/mL的菌懸液，分別注入中華絨螯蟹和克氏原螯蝦的第3步足基部關(guān)節(jié)軟膜處，劑量為0.1mL/只，每個(gè)濃度組蟹和蝦各10只，對(duì)照組分別于同一部位注射0.70%的無菌生理鹽水。接種后隔離養(yǎng)殖于水族箱中，于25～28℃水溫下飼養(yǎng)，不喂食，不換水，連續(xù)觀察4 d。并對(duì)人工感染后發(fā)病的中華絨螯蟹和克氏原螯蝦血液中再次分離病原并進(jìn)行鑒定。

1.4分離菌株生理生化特征鑒定

依據(jù)《一般細(xì)菌常用鑒定方法》［1］、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［2］和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［3］等所述方法進(jìn)行致病菌的生理生化特性試驗(yàn)，然后通過BBL Crystl微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行掃描和統(tǒng)計(jì)分析。

1.5分離菌株16S rRNA基因序列分析

設(shè)計(jì)細(xì)菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增采用通用引物對(duì)（F:5'-AGAGTTTGATCATG GCTCAG-3'，R: 5'-GGTACCTTGTTACGACTT-3'），以分離到的菌株為模板，進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：10×PCR Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.5 μL，引物F、R（10 μmol/L）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.5 μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃3 min，94 ℃40 s，65℃40 s，72℃1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物采用TIANGEN公司DNA快速純化回收試劑盒進(jìn)行回收純化，純化PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。測(cè)序工作由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。所測(cè)序列通過GenBank的BLAST進(jìn)行相似性比對(duì)分析，并通過MegAlign方法［4］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，進(jìn)行同源性分析，最后確定細(xì)菌的種類。

1.6藥敏試驗(yàn)

將經(jīng)鑒定后的純培養(yǎng)擴(kuò)增培養(yǎng)，選擇氟苯尼考、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸多西環(huán)、鹽酸諾氟沙星、鹽酸恩諾沙星、甲砜霉素、硫酸新霉素等生產(chǎn)上常用的9種抗生素（本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)國標(biāo)自制藥敏試紙，藥物均為標(biāo)準(zhǔn)品，由江蘇省水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心贈(zèng)送）作為試驗(yàn)藥物，采用常規(guī)瓊脂擴(kuò)散法［5］進(jìn)行敏感性測(cè)定，以抑菌圈直徑大小作為敏感與耐藥的判定指標(biāo)。并以3倍稀釋法進(jìn)行最小抑菌試驗(yàn)濃度（MIC）試驗(yàn)。藥物的敏感性評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)參考NCCLS標(biāo)準(zhǔn)和CLSI標(biāo)準(zhǔn)（表1）。

表1　9種抗菌類藥物的敏感性評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

2　結(jié)果與分析

2.1發(fā)病蝦、蟹的癥狀

觀察解剖發(fā)病的中華絨螯蟹和克氏原螯蝦發(fā)現(xiàn)，無論是蝦還是蟹行動(dòng)遲緩、肢體無力，少食至不食，翻身困難，嚴(yán)重者無法翻身；解剖蝦蟹可見鰓絲排列不整齊，肝胰臟顏色淡黃，腸道內(nèi)無食，血液凝固緩慢或不凝固。池塘中先發(fā)現(xiàn)克氏原螯蝦先發(fā)病，幾天后出現(xiàn)死亡；隨后中華絨螯蟹出現(xiàn)病癥，同樣幾天后出現(xiàn)死亡。發(fā)病池水質(zhì)指標(biāo)正常。

2.2細(xì)菌的致病力

將純化的優(yōu)勢(shì)菌AH3株和CF株感染健康的中華絨螯蟹和克氏原螯蝦，結(jié)果顯示這兩株菌對(duì)蟹、蝦均有很強(qiáng)的致病力。其中健康蟹的96 h最低致死量分別為2.1×104CFU/g和2.1×105CFU/g，健康蝦的96 h最低致死量分別為3.3×104CFU/g和3.3×104CFU/g，對(duì)照的蟹和蝦在96 h觀察期內(nèi)均正常存活（見表2和表3）。說明AH3株的毒性強(qiáng)于CF株。分別隨機(jī)取3只感染死亡蝦蟹的血液再次分離純化，并進(jìn)行形態(tài)及理化特性等復(fù)核性檢驗(yàn)，表明分離菌檢驗(yàn)結(jié)果與相應(yīng)的感染菌一致。

表2　AH3和CF對(duì)中華絨螯蟹的致病力

表3　AH3和CF對(duì)克氏原螯蝦的致病力

表4　分離菌株AH3和CF的生理生化試驗(yàn)

2.3細(xì)菌鑒定

通過RS瓊脂平板37℃恒溫培育24 h，菌株AH3在營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落呈圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起、黃色，直徑約2.0 mm，生長豐盛；菌株CF菌落呈圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起、綠色，菌落中心有黑點(diǎn)，直徑約1.5 mm，生長豐盛。麥康凱瓊脂平板上生長的AH3菌落呈黃色，CF菌落呈黃色，菌落中心呈玫瑰紅。革蘭染色結(jié)果顯示，菌株AH3和CF均為革蘭陰性，個(gè)體形態(tài)特征相似：短桿狀或近球形、散在、個(gè)別的成雙兩端鈍圓、無芽孢、大?。?.4～0.7）×（1～1.5）μm。分離菌株AH3和CF的系列生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表4，基于BBL Crystl微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的掃描和統(tǒng)計(jì)分析，并對(duì)照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［2］和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［3］，初步鑒定AH3和CF分別為維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）和弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）。

通過16S rRNA的PCR擴(kuò)增，所獲AH3和CF 的PCR產(chǎn)物的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1，經(jīng)測(cè)序分別獲得片段長1 400 bp和1 376 bp的序列。GenBank的BLAST序列相似性比對(duì)分析結(jié)果顯示，AH3菌株與維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii，登錄號(hào)：KT964297.1）的親緣關(guān)系最近，同一性為100%。CF菌株與弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii），登錄號(hào)：KR149315.1）的親緣關(guān)系最近，同一性為99%。

圖1　AH3和CF的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2　嗜水氣單胞菌與弗氏檸檬酸桿菌對(duì)9種抗生素的敏感性

2.4藥敏試驗(yàn)

以NCCLS和CLSI藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（表1），評(píng)判維氏氣單胞菌AH3株和弗氏檸檬酸桿菌CF株對(duì)9種抗菌類藥物的敏感性，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)菌在貼有藥物試紙的MH瓊脂平板上28℃培養(yǎng)24 h后，維氏氣單胞菌AH3對(duì)氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸諾氟沙星、鹽酸恩諾沙星和甲砜霉素等5種藥物敏感，對(duì)鹽酸多西環(huán)和硫酸新霉素素等2種呈中度敏感，對(duì)磺胺嘧啶和磺胺二甲嘧啶等2種耐藥。類似維氏氣單胞菌AH3，弗氏檸檬酸桿菌CF對(duì)氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸諾氟沙星、鹽酸恩諾沙星等4種藥物敏感，但對(duì)甲砜霉素的敏感度低于維氏氣單胞菌AH3，呈中度敏感；對(duì)鹽酸多西環(huán)、硫酸新霉素素、磺胺嘧啶和磺胺二甲嘧啶等4種藥物的敏感性同維氏氣單胞菌AH3。同時(shí)，從最小抑菌濃度也可以發(fā)現(xiàn)（表5），弗氏檸檬酸桿菌CF株的最小抑菌濃度普遍高于維氏氣單胞菌AH3株，說明其耐藥性較高。然而我們從圖2可以發(fā)現(xiàn)，維氏氣單胞菌AH3株雖然對(duì)氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸諾氟沙星、鹽酸恩諾沙星和甲砜霉素等5種藥物敏感，但均出現(xiàn)二次生長的特性，最小抑菌試驗(yàn)結(jié)果同樣表明，維氏氣單胞菌AH3株細(xì)菌在1 mg/L的氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸恩諾沙星中前18 h培養(yǎng)液透明，無菌生長，但到24 h時(shí)，最小抑菌濃度均降到3～9 mg/L，表明這些藥對(duì)維氏氣單胞菌AH3株抑菌有效期較短，可能出現(xiàn)了耐藥性狀。

表5　9種抗生素對(duì)嗜水氣單胞菌AH3和弗氏檸檬酸桿菌CF的最小抑菌濃度

3　討論

3.1中華絨螯蟹和克氏原螯蝦敗血癥的病原及其致病力

中華絨螯蟹和克氏原螯蝦的細(xì)菌性疾病是養(yǎng)殖生產(chǎn)中常見的疾病。近年來，人們已從發(fā)病的中華絨螯蟹、克氏原螯蝦體內(nèi)分離到較常見的病原菌包括嗜水氣單胞菌（Aeormonas hydrophila）、擬態(tài)弧菌（Vibro mimicus）［6-7］、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）［8］、螺原體（Spiroplasma eriocheiris）［9］、易損氣單胞菌（Aeromonas trota）［10］、豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）［11］、弗氏檸檬酸桿菌［12-13］、維氏氣單胞菌［14］，因而引起水產(chǎn)科技工作者的高度關(guān)注。近三年來蘇州吳中區(qū)某養(yǎng)殖區(qū)的中華絨螯蟹和克氏原螯蝦敗血癥呈漫延趨勢(shì)，該研究從吳中區(qū)某養(yǎng)殖區(qū)的中華絨螯蟹和克氏原螯蝦敗血癥中分離到了2株致病菌，經(jīng)鑒定為維氏氣單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌，該病屬于混合感染。這2株菌的致病力較強(qiáng)，維氏氣單胞菌AH3使中華絨螯蟹死亡的最低劑量為5×105CFU/g，低于鄭世雄等［14］分離到的菌株使中華絨螯蟹死亡劑量107CFU/g，該菌對(duì)克氏原螯蝦的死亡劑量更低，為5×104CFU/g。弗氏檸檬酸桿菌是克氏原螯蝦的常見病原，近年來已有多次報(bào)道［13，15］。該研究得到的弗氏檸檬酸桿菌CF的致病力稍弱于維氏氣單胞菌AH3，其致病力與沈錦玉等［13］從克氏原螯蝦中分離到菌株的致病力一致，但高于陳紅蓮等［15］從克氏原螯蝦中分離到菌株的致病力。因此，本次分離到的維氏氣單胞菌AH3株和弗氏檸檬酸桿菌CF株均為強(qiáng)毒菌株；從中華絨螯蟹和克氏原螯蝦敗血癥的流行特點(diǎn)也說明2株菌的混合感染引起了池塘蝦蟹大量發(fā)病和死亡。根據(jù)癥狀與病原特點(diǎn)，作者認(rèn)為該疾病為中華絨螯蟹和克氏原螯蝦細(xì)菌性敗血癥。

3.2維氏氣單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌對(duì)抗生素的感受性

根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)養(yǎng)殖者正確合理的施藥具有很強(qiáng)的指導(dǎo)性。從藥敏試驗(yàn)結(jié)果看，我們分離到的維氏氣單胞菌AH3株和弗氏檸檬酸桿菌CF株對(duì)氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸諾氟沙星、鹽酸恩諾沙星敏感，但其中的鹽酸環(huán)丙沙星已被禁止在水產(chǎn)動(dòng)物中應(yīng)用，因此不能推廣應(yīng)用。2株菌對(duì)鹽酸多西環(huán)和硫酸新霉素素呈中度敏感，對(duì)磺胺嘧啶和磺胺二甲嘧啶耐藥；而對(duì)甲砜霉素的敏感性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，弗氏檸檬酸桿菌CF株低于維氏氣單胞菌AH3株。這種細(xì)菌對(duì)抗生素感受性的差異可能與細(xì)菌的種類和致病菌所接觸抗生素類藥物的頻率有關(guān)［9］。該研究的藥敏試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，維氏氣單胞菌AH3株雖然對(duì)上述抗生素敏感，但其有效期較短。當(dāng)細(xì)菌在貼有藥物試紙的MH瓊脂平板上28℃培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)了二次生長，說明維氏氣單胞菌AH3株出現(xiàn)了抗性。養(yǎng)殖者也反映，中華絨螯蟹和克氏原螯蝦敗血癥的治療效果越來越差，這與近兩年發(fā)病池塘常使用恩諾沙星、氟苯尼考等抗生素而產(chǎn)生抗性有關(guān)。因此，建議養(yǎng)殖生產(chǎn)者在生產(chǎn)實(shí)際中選擇有效藥物并采用多種藥物交叉使用的方法，減緩病原菌對(duì)抗生素等藥物耐藥性產(chǎn)生的時(shí)間。

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The etiological agents of bacterial septicemia in Eriocheir sinensis and Procambarus clarkia

Jiang Guangming1，Qian Caiyuan1，Gu Xuelin1，Wei Bin1，Xu le2，Song Xuehong2
（1.Suzhou Wuzhong Aquaculture Technology Extension Station，Suzhou 215128，China；2.School of Biology and Basic Medical Sciences，Soochow University，Suzhou 215123，China）

Two strains of bacteria were isolated from Chinese mitten crab（Eriocheir sinensis）and red swamp crayfish（Procambarus clarkii）with naturally occurring bacterial septicemia in a polyculture system.Both bacterial strains were tested for their biological traits，pathogenicity and drug sensitivity，to determine the bacterial entity，etiological significance，and drug resistance characteristics.The bacteria were isolated from blood samples of E.sinensis and P.clarkia，and sub-cultured repeatedly to obtain pure bacterial culture.The pure bacterial cultures were subsequently used to identify the bacterial species by their biological traits，physical and chemical properties，16S rRNA gene sequence，and phylogenetic characterization.The pathogenicity test was performed by infecting healthy crab and/or crayfish with serial dilutions of bacteria suspension from these two strains.The susceptibility of these bacteria to nine common antimicrobial agents was determined using agar diffusion technique and serial dilution method.The two bacterial strains isolated from pure cultures were identified as Aeromonas veronii and Citrobacter freundii，respectively，and both showed stronger pathogenicity，but were sensitive to four antibiotics，including florfenicol，ciprofloxacin，norfloxacin lactate，and norfloxacin hydrochloride.

Eriocheir sinensis；Procambarus clarkia；bacterial septicemia；Aeromonas veronii；Citrobacter freundii；drug susceptibility

中途分類號(hào)：S966.1A

1004-2091（2016）04-0046-06

江蘇省三新工程項(xiàng)目（Y2014-36）、蘇州市應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目（SYN201505）

姜光明（1982-），男，工程師，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)、疾病E-mail：jiang_guangming@aina.com

宋學(xué)宏，副教授，E-mail：songxh@suda.edu.cn

（2015-12-25）