陳靜宇，李　晶，2，張淑梅，2，孟利強(qiáng)，2

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所黑龍江省生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150020）

枯草芽孢桿菌B91產(chǎn)芽孢發(fā)酵條件優(yōu)化

陳靜宇1，李晶1，2，張淑梅1，2，孟利強(qiáng)1，2

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所黑龍江省生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150020）

在三角瓶培養(yǎng)條件下，采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)枯草芽孢桿菌B91發(fā)酵條件裝液量、起始pH值及溫度進(jìn)行了優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了響應(yīng)面分析，獲得了響應(yīng)面回歸模型，模型擬合良好，確定了菌株B91最佳的產(chǎn)孢發(fā)酵條件為裝液量44.7 mL、初始pH 8.3、溫度31.5℃。在最優(yōu)條件下發(fā)酵培養(yǎng)，芽孢濃度為44.89億±0.29億/mL，較優(yōu)化前提高了36.4%。

枯草芽孢桿菌；芽孢；響應(yīng)面；發(fā)酵條件；優(yōu)化

枯草芽孢桿菌是目前研究最為深入的一種芽孢桿菌，它能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)、畜牧業(yè)及植物病害防治等領(lǐng)域［1］。且多數(shù)菌株對(duì)人類和環(huán)境都具有很好的安全性，所以近年來(lái)枯草芽孢桿菌成為食物病害防治領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外已有較多報(bào)道［2］。而枯草芽孢桿菌活菌制劑的活菌數(shù)量是其制劑穩(wěn)定性的重要保障，所以微生態(tài)制劑中活菌數(shù)的降低直接影響其使用效果，這一問(wèn)題可以通過(guò)提高活菌制劑中的芽孢比例得以緩解［3］。通過(guò)調(diào)控發(fā)酵條件提高發(fā)酵液中芽孢的比例，芽孢具有較好的抗逆性，可以抵抗外界的環(huán)境壓力，可以提高活菌制劑的穩(wěn)定性，保證其使用效果［4］。

本研究所用菌株枯草芽孢桿菌B91是本實(shí)驗(yàn)室的自有菌株，能夠抑制多種植物病原菌，具有較好的田間防效，具有廣泛的應(yīng)用前景。本文對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高其發(fā)酵液中菌體密度及芽孢形成率，為下一步擴(kuò)大生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌種

枯草芽孢桿菌B91菌株由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖9.4 g/L，酵母膏6.9 g/L，氯化鈉3 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO40.2 g/L，MnSO410.2 mg/L，CaCO30.2 g/L，培養(yǎng)基采用濕熱滅菌：121℃，15 min。

1.3培養(yǎng)方法

1.3.1種子活化及培養(yǎng)

種子活化及培養(yǎng)參照文獻(xiàn)［5］。

1.3.2發(fā)酵培養(yǎng)

接種量均為1%，250mL的三角瓶裝液量為50 mL，搖床轉(zhuǎn)速為150 rpm，30℃下培養(yǎng)48 h。

1.4芽孢計(jì)數(shù)

沸水浴處理待測(cè)樣品20 min，滅活未形成芽孢的營(yíng)養(yǎng)體，冷卻后采用菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)測(cè)得樣品芽孢數(shù)［6］。

1.5單因素實(shí)驗(yàn)

選擇裝液量、發(fā)酵液初始pH值、發(fā)酵溫度作為主要優(yōu)化因素，裝液量分別設(shè)為30 mL、50 mL、70 mL、90 mL，發(fā)酵pH值分別設(shè)為5、6、7、8、9，發(fā)酵溫度分別設(shè)為28℃、31℃、34℃、37℃、40℃。

1.6響應(yīng)面分析

采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，在搖瓶發(fā)酵條件下優(yōu)化三個(gè)發(fā)酵條件：裝液量、pH、溫度，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)（表1）。

表1　Box-Behnken設(shè)計(jì)因子代碼與水平Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken design

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1裝液量對(duì)芽孢數(shù)量的影響

圖1　裝液量對(duì)芽孢數(shù)量的影響Fig.1 Effects of volume loading on the concentration of spores

在搖瓶發(fā)酵過(guò)程中，裝液量直接關(guān)系發(fā)酵液的溶氧系數(shù)，裝液量越少溶氧越高，反之亦然。如圖1所示，搖瓶的裝液量對(duì)芽孢形成數(shù)量影響顯著（P＜0.05），裝液量為50 mL/250mL時(shí)芽孢數(shù)量最多，達(dá)到40.9億/mL，當(dāng)裝液量繼續(xù)增加時(shí)，由于溶氧降低，抑制了芽孢的形成，所以芽孢形成數(shù)量減少。

2.1.2初始pH對(duì)芽孢數(shù)量的影響

圖2　初始pH對(duì)芽孢數(shù)量的影響Fig.2 Effects of initial pH on the concentration of spores

如圖2所示，發(fā)酵初始pH值對(duì)芽孢形成的影響變化趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵初始pH值在5～7，芽孢形成數(shù)量迅速增加，而當(dāng)發(fā)酵初始pH值為8時(shí)芽孢數(shù)量達(dá)到最大42.1億/mL，隨著發(fā)酵初始pH值繼續(xù)增加，芽孢數(shù)量呈逐漸下降趨勢(shì)，所以初始pH 8設(shè)為響應(yīng)面試驗(yàn)中心試驗(yàn)點(diǎn)。

2.1.3發(fā)酵溫度對(duì)芽孢數(shù)量的影響

圖3　發(fā)酵溫度對(duì)芽孢數(shù)量的影響Fig.3 Effects of temperature on the concentration of spores

發(fā)酵溫度影響菌體的生長(zhǎng)繁殖，如圖3所示，發(fā)酵溫度31℃時(shí)芽孢形成數(shù)量最多，為43.5億/mL，隨著發(fā)酵溫度的升高芽孢數(shù)量呈下降趨勢(shì)，所以選擇發(fā)酵溫度30℃進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，經(jīng)過(guò)多元回歸擬合，獲得的芽孢數(shù) （Y）對(duì)X1、X2和X3三個(gè)自變量的三元二次回歸模型方程：Y=44.54-3.1375A-0.125B+1.2375C -2.625AB-1.7AC+1.625BC-6.17A2-1.595 B2-6.82 C2。利用軟件Design Expert 8.0進(jìn)行求導(dǎo)，解出極值點(diǎn)，算出每個(gè)因素的最佳值：裝液量為44.74 mL、初始pH為8.34、溫度為31.52℃，此時(shí)模型的理論最優(yōu)芽孢濃度為45.18億/mL。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Response surface design and results

表3為回歸模型方差分析結(jié)果，由結(jié)果可知模型是顯著的 （P≤0.0001），并且決定系數(shù)為0.9832，說(shuō)明該模型是準(zhǔn)確可靠的，因此，可用此模型對(duì)枯草芽孢桿菌B91的發(fā)酵條件進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)［6，7］。

表3　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)回歸分析Tab.3 Analysis of variance of response surface design

以回歸方程為基礎(chǔ)，采用軟件分析繪制兩兩因素間相應(yīng)的響應(yīng)面分析圖（圖4～6），響應(yīng)曲面的極值點(diǎn)是兩個(gè)因素交互的最大值，根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果，枯草芽孢桿菌B91菌株芽孢濃度最優(yōu)極值點(diǎn)為裝液量為44.7 mL、初始pH為8.3、溫度為31.5℃，預(yù)測(cè)最優(yōu)值為45.18億/mL。

圖4　裝液量和pH交互作用對(duì)芽孢數(shù)影響Fig.4　Response surface plot of spores concentration versus volume loading and pH

圖5　裝液量和溫度交互作用對(duì)芽孢數(shù)影響Fig.5　Response surface plot of spores concentration versus volume loading and temperature

圖6　pH和溫度互作用對(duì)芽孢數(shù)影響Fig.6　Response surface plot of spores concentration versus pH and temperature

3　討論與結(jié)論

培養(yǎng)條件對(duì)于細(xì)菌的繁殖，尤其是芽孢的產(chǎn)生尤為重要，在單因素實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)最適合B91菌株搖瓶發(fā)酵的條件為裝液量50 mL/250mL，初始pH值8，發(fā)酵溫度30℃，在此基礎(chǔ)上發(fā)酵48h芽孢形成較好為43.5 億/mL。在上述條件基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)回歸模型的決定系數(shù)為0.9832，說(shuō)明該模型擬合程度良好，最優(yōu)培養(yǎng)條件為裝液量44.74 mL、初始pH 8.34、溫度31.52℃。在最優(yōu)條件下發(fā)酵培養(yǎng)，芽孢濃度為44.89億±0.29億/mL與模型的理論最優(yōu)芽孢濃度為45.18億/mL相近，說(shuō)明該模型擬合的有效性。

［1］ 趙朋超，王建華，權(quán)春善，等.枯草芽孢桿菌抗菌肽生物合成的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生物工程雜志，2010，30（10）：108-113.

［2］ 張彩鳳.生防菌枯草芽孢桿菌的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代農(nóng)村科技，2015，（21）：47-47.

［3］甄靜，郭直岳，謝寶恩，等.枯草芽孢桿菌XK-1產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（27）：146-151.

［4］ 郭夏麗，狄源寧，王巖，等.枯草芽孢桿菌產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化［J］.中國(guó)土壤與肥料，2012，（03）：99-103.

［5］ 孟利強(qiáng)，趙曉宇，陳靜宇，等.響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌B91發(fā)酵培養(yǎng)基［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，（25）：26-29.

［6］ 陳琳，孟祥晨.響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌代謝產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵條件［J］.食品科學(xué)，2011，32，（3）：176-180.

［7］ 王西祥，丁延芹，杜秉海，等.響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌NS178產(chǎn)芽孢發(fā)酵工藝［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，（04）：59-65.

Optimization of spore production in fermentation conditions aboutBacillus subtilisB91

CHEN Jing-yu1，LI Jing1，2，ZHANG Shu-mei1，2，MENG Li-qiang1，2
（1.Heilongjiang Key Laboratory of Biotechnology，Institute of Microbiology of Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010，China；2.Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150020，China）

Under the condition of cultivation in the flask，by using single-factor experiment，Bacillus subtilisB19's liquid medium volume，initial PH and fermentation temperature were optimized.On the basis of response surface analysis，the response-surface model was obtained and model fitting did well.The optimum spore production and fermentation conditions ofBacillus subtilisB19 were determined.Finally it finds out that liquid volume is 44.7 mL，initial PH is 8.3 and fermentation temperature is at 31.5℃.Under the condition of the optimal fermentation cultivation，spore concentration is 44.89billion±0.29 billion/mL，which is increased by 36.4%before optimization.

Bacillus subtilis；Spore；Response surface；Fermentation condition；Optimization

Q781

A

1674-8646（2016）12-0001-04

2016-05-17

黑龍江省科學(xué)學(xué)部委員指導(dǎo)專項(xiàng)（2014HK013）

陳靜宇（1980-），男，黑龍江哈爾濱人，學(xué)士，實(shí)驗(yàn)師，從事農(nóng)業(yè)微生物研究。

孟利強(qiáng)（1983-），男，內(nèi)蒙古呼和浩特人，碩士，副研究員，從事農(nóng)業(yè)微生物、分子生物學(xué)研究，e-mail：mengliqiang83420@163.com。